一种基于特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用技术

本公开涉及一种基于特异性免疫细胞，特别是基于携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌激活的特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用。本公开在体外提取T细胞，通过减毒李斯特菌激活的抗原递呈细胞与T细胞进行共培养，在体外产生具有特定肿瘤抗原肽的T细胞，特异性T细胞回输体内产生肿瘤特异性免疫反应。本公开的技术方案可以可特异性地激活肿瘤特异性T细胞，从而引发一系列抗肿瘤免疫反应，且操作过程无需对自体细胞进行基因改造，靶向性和安全性都有显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用
本公开主要涉及生物
，具体来说，本公开涉及一种肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用。更具体的，本公开涉及一种基于携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌激活的特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用。
技术介绍
随着对肿瘤的发生发展、机体抗肿瘤免疫应答、肿瘤免疫逃逸及肿瘤微环境等的深入研究和认识，以免疫治疗为基础的肿瘤生物疗法作为一种新兴的现代肿瘤治疗模式，有效地弥补了传统治疗方法的一些缺陷，为肿瘤的治疗提供了新的思路和方向。目前，肿瘤免疫治疗的主要研究方向包括肿瘤疫苗、检查点抑制剂、过继免疫治疗、治疗性抗体等。细胞的过继免疫治疗(adoptivecelltherapy，ACT)是将机体的免疫细胞在体外诱导、修饰、扩增，把筛选出的具有特异高效肿瘤杀伤活性的效应细胞回输到患者体内，以抑制和杀伤肿瘤的一种疗法[1]，是继手术切除、化疗、放疗的传统方法之后的一种具有良好临床应用前景与疗效的新型抗肿瘤手段。随着新型过继免疫治疗技术的不断发展，具有抗原特异性的T细胞免疫治疗技术显示出其优越性。T细胞的过继免疫治疗主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(Tumorinfiltratinglymphocytes，TILs)的过继性免疫治疗和通过基因修饰T细胞的过继性免疫治疗。TILs是指从手术切除的肿瘤组织或转移的淋巴结中分离出来的淋巴细胞，这些细胞通过分泌细胞因子，如干扰素、IL-2和肿瘤坏死因子直接裂解肿瘤细胞。TILs虽然在临床上具有强大的细胞增殖能力和杀伤作用，但具有一定的肿瘤类型限制和MHC限制性；且在细胞的取材方面也受到限制，有的肿瘤不能切除，而可切除的肿瘤内淋巴细胞的浸润程度也不同，导致淋巴细胞的抗肿瘤活性也不同，这些都限制了TILs在肿瘤临床治疗中的应用[2]。基因修饰T细胞的过继性免疫治疗包括对T细胞受体进行修饰的T细胞(Tcellreceptor-geneengineeredTcells，TCR-T)治疗，对嵌合抗体受体修饰的T细胞(ChimericantigenreceptorTCells,CAR-T)治疗。其中，对T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)进行基因修饰的过继免疫治疗是通过基因转移技术构建肿瘤抗原特异性TCR，通过病毒载体等方法将其转入T细胞，经大量扩增后回输患者从而发挥抗肿瘤效应的一种治疗技术。TCR-T的细胞治疗方法可适用于多种实体肿瘤，在制备过程中只需鉴定出非常少量的具有抗肿瘤活性的细胞作为分离抗原特异性TCR基因的基础。TCR基因一旦被整合到相应的转导载体中，就可包装出病毒后感染患者外周血T细胞并进行大量扩增，用于多种肿瘤类型的治疗[3]。然而，TCR-T疗法的T细胞识别肿瘤特异性抗原治疗技术的限制性之一是TCR识别特异性抗原的能力具有MHC限制性，如何提高TCR的亲和能力以及扩大适用范围是该方法亟需解决的主要问题[4-6]。CAR-T疗法是通过将患者自身血液收集的T细胞进行基因工程处理，从而在其表面表达能够和特异性肿瘤抗原结合的嵌合受体，同时在受体胞内段加上引起T细胞活化的信号传递区域，使得回输的细胞能够通过非MHC限制的方式选择性的靶向和杀伤肿瘤细胞[7]。CAR-T疗法能够产生大量针对肿瘤抗原的特异性T细胞，且改造的CAR-T细胞识别肿瘤过程中不受MHC的限制，显示出良好的靶向性，不仅能够识别肿瘤表面的蛋白质抗原，也能利用糖蛋白中聚糖和糖脂类抗原，具有更多肿瘤抗原靶点的选择。此外，CAR-T细胞可在体内存活较长时间，持续发挥作用；使用患者自身T细胞构建的CAR-T细胞降低了排异反应风险。然而该方法目前仅适于血液癌，而在实体瘤临床研究上未出现良好效果，且存在细胞因子风暴、CAR-T细胞难以归巢到肿瘤部位、脱靶杀伤正常组织细胞及其他神经毒性症状[8-11]。由于现有细胞的过继免疫疗法存在对肿瘤抗原的亲和力不足，以及细胞因子风暴、脱靶效应等问题，因此，亟需开发一种新的具有肿瘤抗原特异性的T细胞，以解决T细胞免疫治疗中存在的安全性和靶向性的问题。引用文献：[1]GattinoniL,PowellDJ,RosenbergSA,etal.Adoptiveimmunotherapyforcancer:buildingonsuccess[J].Naturereviews.Immunology,2006,6(5):383-393.[2]JohnsonLA,JuneCH.Drivinggene-engineeredTcellimmunother-apyofcancer[J].CellRes,2017,27:38-58.[3]KiebackE,UckertW.EnhancedTcellreceptorgenetherapyforcancer[J].Expertopiniononbiologicaltherapy[J],2010,10(5):749-762.[4]MorganRA,ChinnasamyN,Abate-DagaD,etal.Cancerregressionandneurologicaltoxicityfollowinganti-MAGE-A3TCRgenetherapy[J].JImmunother,2013,36(2):133-151.[5]RobbinsPF,MorganRA,FeldmanSA,etal.TumorregressioninpatientswithmetastaticsynovialcellsarcomaandmelanomausinggeneticallyengineeredlymphocytesreactivewithNY-ESO-1[J].JClinOncol,2011,29(7):917-924.[6]ParkhurstMR,YangJC,LanganRC,etal.Tcellstargetingcarcinoembryonicantigencanmediateregressionofmetastaticcolorectalcancerbutinduceseveretransientcolitis[J].MolTher,2011,19(3):620-626.[7]RamosCA,DottiG.Chimericantigenreceptor(CAR)-engineeredlymphocytesforcancertherapy[J],ExpertOpinBiolTher,2011,11(7):855-873.[8]MaudeSL,FreyN,ShawPA,AplencR,BarrettDM,BuninNJ,etal.ChimericantigenreceptorTcellsforsustainedremissionsinleukemia,2014,371(16):1507-17.[9]LeeDW,GardnerR,PorterDL,etal.Currentconceptsinthediagnosisa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞是将免疫细胞与修饰细胞接触后获得的特异性免疫细胞；其中，所述修饰细胞由具有目标效应活性的细胞和重组李斯特菌进行接触后获得，所述重组李斯特菌含有：(i)重组核酸分子；或(ii)重组质粒；或(iii)重组表达载体；或所述重组李斯特菌表达：(iv)重组蛋白；其中，/n所述(i)重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或如SEQID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽；/n所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体包含所述(i)重组核酸分子的序列；/n所述(iv)重组蛋白由所述(i)重组核酸分子编码，或由所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞是将免疫细胞与修饰细胞接触后获得的特异性免疫细胞；其中，所述修饰细胞由具有目标效应活性的细胞和重组李斯特菌进行接触后获得，所述重组李斯特菌含有：(i)重组核酸分子；或(ii)重组质粒；或(iii)重组表达载体；或所述重组李斯特菌表达：(iv)重组蛋白；其中，
所述(i)重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列或如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQIDNO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽；
所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体包含所述(i)重组核酸分子的序列；
所述(iv)重组蛋白由所述(i)重组核酸分子编码，或由所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体表达。


2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其特征在于，所述具有目标效应活性的细胞选自巨噬细胞、单核细胞和/或树突状细胞；优选地，所述抗原呈递细胞选自骨髓诱导巨噬细胞，和/或骨髓诱导树突状细胞；
所述免疫细胞为T细胞；优选地，所述免疫细胞为CD8+T细胞。


3.根据权利要求1或2所述的工程化细胞，其特征在于，所述(i)重组核酸分子中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQIDNO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。


4.根据权利要求1-3任一项所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。


5.根据权利要求4所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQIDNO:7所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。


6.根据权利要求1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：代楠，张可，赵勇刚，
申请(专利权)人：苏州若泰医药科技有限公司，上海若泰医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32