枯草芽孢杆菌黑色变种培养基及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌黑色变种培养基及其制备方法与应用，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：胰蛋白胨0.5～4.0g，葡萄糖0.5～2.0g，氯化钠0.5～1.0g，磷酸氢二钾0.5～1.0g，七水硫酸镁0.5～1.0g，L‑天冬酰胺0.5～1.0g，L‑酪氨酸0.5～1.0g，干酪素溶液10mL～60mL，微量盐溶液1～2mL，琼脂18～20g，余量为蒸馏水。本发明专利技术的枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，诱导作用强，市面上枯草芽孢杆菌黑色变种产品均适用，而且在诱导产生稳定黑色素时，该培养基操作简单，成本低，筛选效果强，还为其芽孢的配置应用提供菌种保障。

【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌黑色变种培养基及其制备方法与应用
本专利技术涉及微生物，具体地，涉及一种枯草芽孢杆菌黑色变种培养基及其制备方法和应用，尤其是一种枯草芽孢杆菌黑色变种产生稳定色素的诱导培养基及其配置和使用方法。
技术介绍
枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillussubtilisvar.niger)，国际上称为萎缩芽孢杆菌，非致病菌，枯草芽孢杆菌的一个亚种。革兰氏阳性芽孢杆菌，长2.0～4.0μm，宽0.5～1.0μm，单个或呈短链状排列，芽孢椭圆形，中生，不膨大。枯草芽孢杆菌黑色变种因能产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学物质很强抗性的芽孢，可以作为消毒剂检测及灭菌质量控制方面的质量控制标准菌株进行应用。《美国药典》将枯草芽孢杆菌黑色变种作为干热消毒、环氧乙烷控制的生物指示剂及用于医药物品消毒与无菌保证；《欧洲药典》将其作为杀菌法的生物指示剂；我国在《中国药典》、《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB15981-1995)、《消毒技术规范》均将枯草芽孢杆菌黑色变种作为消毒灭菌指示微生物；英国、瑞士等国标准协会在健康产品相关的标准或与医疗器械相关的标准中已将该菌株作为环氧乙烷灭菌、干热灭菌和其它液体化学消毒剂的指示剂。根据相关资料，枯草芽孢杆菌黑色变种在含有酪氨酸的培养基上可产生黑色菌落，但是黑色素形成十分不稳定。目前，尚无枯草芽孢杆菌黑色变种能产生稳定色素的培养基，因此，探索一种便捷、可靠、稳定的使枯草芽孢杆菌黑色变种产生黑色素的诱导培养基十分必要。申请公布号为CN105670964A的专利技术公开了萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用。萎缩芽孢杆菌BsR05菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNO.11665。采用本专利技术菌株制备的萎缩芽孢杆菌BsR05的液体悬浮剂对黄瓜灰霉病具有特异的防治作用，防效高平均防效在70％以上。该萎缩芽孢杆菌产生黑色素量少不稳定。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供一种枯草芽孢杆菌黑色变种培养基及其制备方法和应用。本专利技术的第一方面提供一种枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：胰蛋白胨0.5～4.0g，葡萄糖0.5～2.0g，氯化钠0.5～1.0g，磷酸氢二钾0.5～1.0g，七水硫酸镁0.5～1.0g，L-天冬酰胺0.5～1.0g，L-酪氨酸0.5～1.0g，干酪素溶液10mL～60mL，微量盐溶液1～2mL，琼脂18～20g，余量为蒸馏水。优选地，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：胰蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，L-天冬酰胺1.0g，L-酪氨酸0.5g，干酪素溶液10ml，微量盐溶液1mL，琼脂20g，余量为蒸馏水。优选地，所述干酪素溶液单独配置，干酪素溶液的每100mL体系如下：干酪素5.0g，溶剂为0.1mol/LNaOH；将干酪素加入溶剂后加热溶解得到。优选地，所述微量盐溶液单独配置，微量盐溶液的每1000mL体系如下：七水合硫酸亚铁1.0～2.0g，二水合氯化铜0.01～0.05g，六水合氯化钴0.01～0.05g，二水合钼酸钠0.01～0.05g，氯化锌0.01～0.02g，硼酸2.0～3.0g，四水合二氯化锰1.0～2.0g，酒石酸钠1.0～2.0g，余量为蒸馏水。优选地，所述微量盐溶液的每1000mL体系如下：七水合硫酸亚铁1.360g，二水合氯化铜0.027g，六水合氯化钴0.040g，二水合钼酸钠0.025g，氯化锌0.020g，硼酸2.850g，四水合二氯化锰1.800g，酒石酸钠1.770g，余量为蒸馏水。本专利技术的第二方面提供一种上述枯草芽孢杆菌黑色变种培养基的制备方法，包括以下步骤：(1)准备原料：按配比分别称取胰蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、琼脂、量取微量盐溶液和干酪素溶液，所述微量盐溶液和干酪素溶液提前单独配置好；(2)配置：在蒸馏水中，将步骤(1)中的原料按照胰蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、琼脂、微量盐溶液和干酪素溶液的顺序逐一加入，待每一种原料溶解后加下一个原料，然后使用质量浓度为100g/L的NaOH或质量浓度为100g/L的HCl调节体系pH至7.0±0.2；将体系在115℃～121℃灭菌15min～30min后得到枯草芽孢杆菌黑色变种培养基。所述灭菌是指利用高压蒸汽灭菌。本专利技术的第三方面提供上述枯草芽孢杆菌黑色变种培养基在诱导产生稳定黑色素中的应用。优选地，所述诱导产生稳定黑色素的方法包括以下步骤：(1)将配置好的枯草芽孢杆菌黑色变种培养基倒入无菌培养皿，每皿25～30ml，待用；(2)将枯草芽孢杆菌黑色变种菌株在步骤(1)准备好的培养基上划线或涂布接种，36℃±1℃增殖培养72h～96h；在培养基上得到稳定的黑色菌落；(3)挑取培养基上培养得到的黑色菌落后提取其中的黑色素。优选地，所述枯草芽孢杆菌黑色变种为B.subtilisvar.nigerATCC9372。黑色素(melanin)是不溶于水和一般有机溶剂的多聚化合物，它的基础结构是一些共价交联的吲哚环。酪氨酸是合成黑色素的前体物，酪氨酸在酪氨酸氧化酶的催化作用下氧化生成二羟苯丙氨酸(多巴)，继续氧化生成多巴醌，再进一步氧化闭环生成5,6-二羟吲哚，再转化成5,6-吲哚二醌，在酶的作用下，最后氧化聚合而形成黑色素。在此过程中起决定性作用的酶是酪氨酸酶。酪氨酸酶，又叫多酚氧化酶，是一种铜离子与酶蛋白相结合的金属酶，主要参与微生物中黑色素、多酚类物质形成的过程。酪氨酸酶同时具有加氧酶、氧化酶的功能，是生命体中合成黑色素的关键酶。根据《伯杰细菌鉴定手册》，枯草芽孢杆菌黑色变种可在含有酪氨酸的培养基中形成黑色素，但色素形成不十分稳定。究其原因，枯草芽孢杆菌黑色变种虽然含有酪氨酸酶能分解酪氨酸产生黑色素，但当其生长的培养基含有丰富的碳源、氮源时，并不利用酪氨酸产生黑色素(一般营养琼脂和营养肉汤中碳源、氮源均比较丰富，含量在3～10g左右)。目前，市面上没有枯草芽孢杆菌黑色变种显色培养基且相关研究较少，本专利技术对培养基成分进行研究和对比，找到一种既不影响枯草芽孢杆菌黑色变种的正常生长，又能稳定产生黑色素的培养基。本专利技术培养基成分中葡萄糖作为碳源提供能量、胰蛋白胨作为氮源供菌株生长，L-酪氨酸作为产生黑色素的底物成分，L-天冬酰胺、干酪素(又称酪蛋白)富含氨基酸，作为补充氮源促进菌株生长，磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠作为无机盐，主要提供目标菌生长所需的钾、镁、钠元素，微量盐溶液主要提供目标菌生长需要的微量元素。本专利技术培养基的重点是控制各成分含量，一方面使枯草芽孢杆菌黑色变种可以快速稳定生长，另一方面又不影响其酪氨酸代谢产生黑色素的过程。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、本专利技术的枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，可作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，其特征在于，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：胰蛋白胨0.5～4.0g，葡萄糖0.5～2.0g，氯化钠0.5～1.0g，磷酸氢二钾0.5～1.0g，七水硫酸镁0.5～1.0g，L-天冬酰胺0.5～1.0g，L-酪氨酸0.5～1.0g，干酪素溶液10mL～60mL，微量盐溶液1～2mL，琼脂18～20g，余量为蒸馏水。/n

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，其特征在于，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：胰蛋白胨0.5～4.0g，葡萄糖0.5～2.0g，氯化钠0.5～1.0g，磷酸氢二钾0.5～1.0g，七水硫酸镁0.5～1.0g，L-天冬酰胺0.5～1.0g，L-酪氨酸0.5～1.0g，干酪素溶液10mL～60mL，微量盐溶液1～2mL，琼脂18～20g，余量为蒸馏水。


2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，其特征在于，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：胰蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，L-天冬酰胺1.0g，L-酪氨酸0.5g，干酪素溶液10ml，微量盐溶液1mL，琼脂20g，余量为蒸馏水。


3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，其特征在于，所述干酪素溶液单独配置，干酪素溶液的每100mL体系如下：干酪素5.0g，溶剂为0.1mol/LNaOH；将干酪素加入溶剂后加热溶解得到。


4.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，其特征在于，所述微量盐溶液单独配置，微量盐溶液的每1000mL体系如下：七水合硫酸亚铁1.0～2.0g，二水合氯化铜0.01～0.05g，六水合氯化钴0.01～0.05g，二水合钼酸钠0.01～0.05g，氯化锌0.01～0.02g，硼酸2.0～3.0g，四水合二氯化锰1.0～2.0g，酒石酸钠1.0～2.0g，余量为蒸馏水。


5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌黑色变种培养基，其特征在于，所述微量盐溶液的每1000mL体系如下：七水合硫酸亚铁1.360g，二水合氯化铜0.027g，六水合氯化钴0.040g，二水合钼酸钠0.025g，...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚海燕，汤琳，吴阿娜，怀红燕，王琰，
申请(专利权)人：上海市环境监测中心上海长三角区域空气质量预测预报中心，
类型：发明
国别省市：上海;31