一种雷帕霉素的纯化方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及雷帕霉素的纯化方法，该方法包括：在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；将活性炭加入滤液中，得到第一中间产物；用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。此方法通过活性炭吸附/解吸附‑高效逆流色谱分离雷帕霉素，具有工艺操作性强，产品纯度高，收率高，适合在工业规模上生产等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种雷帕霉素的纯化方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种雷帕霉素的纯化方法。
技术介绍
雷帕霉素(Rapamycin，RPM)又称西罗莫司(Sirolimus)，是一种新型大环内酯类强效免疫抑制剂，1999年美国FDA批准作为新型临床抗肾移植排斥反应药物，2001年获欧洲药物管理局(EMA)批准上市，2010年中国食品药品监督管理局(CFDA)批准上市。雷帕霉素相比目前临床使用的免疫抑制药物环孢素A和他克莫司(FK506)，具有口服剂量更小(每次仅需2～3mg)、抗排异作用更强，且副作用更少的优势，是目前市售最好的免疫抑制剂。另外，《Cell》、《Blood》、《Gut》等权威杂志研究表明雷帕霉素还具有治疗糖尿病、肥胖症、帕金森、胰腺癌等疑难杂症的新潜能，预示了雷帕霉素未来的应用前景十分广阔。雷帕霉素主要通过吸水链霉菌或游动链霉菌微生物发酵法生产，目前发酵水平还比较低，大都小于1g/L。而且雷帕霉素亲脂性,易溶于甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂，极微溶于水，给雷帕霉素下游提取纯化带来极大困难。常规雷帕霉素提取大致流程：发酵结束后收集菌丝体，有机溶剂浸提，有机溶剂萃取、活性炭脱色、过滤除活性炭、滤液降压浓缩、硅胶柱层析、冷却析晶技术得到雷帕霉素。该方法不仅工艺较为繁琐，而且在工业操作上存在一定困难。如链霉菌经长时间工业补料发酵，下罐时菌丝体含量较高、较粘稠，不易过滤，需加水稀释；雷帕霉素主要位于菌丝体内，但生产发现发酵液也存在可观雷帕霉素，直接废弃较浪费；常规采用有机溶剂浸提、萃取等，不同类型有机溶剂用量大，对人体对环境均存在一定危害。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种雷帕霉素的纯化方法，采用活性炭吸附/解吸附-高效逆流色谱分离雷帕霉素的方式，不仅工艺操作性强，而且可以有效提高雷帕霉素的收率。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种雷帕霉素的纯化方法，所述纯化方法包括：在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；将活性炭加入滤液中，得到第一中间产物；用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。在一个实施例中，所述第一温度为35-42℃。在一个实施例中，所述第一溶剂为乙醇或丙酮；和/或，所述第二溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种；和/或，所述第三溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。在一个实施例中，所述在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液步骤中，抽提时间为2-4小时。在一个实施例中，所述雷帕霉素发酵液体积与所述第一有机溶剂的体积比为1:1-1:2。在一个实施例中，所述活性炭与所述第二有机溶剂的体积比为1:4.5-1:5.5；和/或，所述活性炭与所述第三有机溶剂的体积比为1:1.5-1:2.5。在一个实施例中，所述将活性炭加入滤液中，得到第一中间产物步骤包括：将活性炭加入滤液中，搅拌吸附后，过过滤器得到第一中间产物，所述第一中间产物为活性炭滤饼。在一个实施例中，所述将所述滤液过活性炭，得到第一中间产物步骤中，所述活性炭的质量与所述滤液的体积比为1:50-1:100g/mL。在一个实施例中，所述将所述滤液过活性炭，得到第一中间产物步骤中，搅拌吸附的时间为1-5小时。在一个实施例中，所述用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液步骤包括：用第三有机溶剂对所述第二中间产物解吸附循环洗涤3-5次，每次1-2小时，重复解吸附步骤2-5次，将洗脱液合并后，浓缩洗脱液，得到浓缩液。本专利技术提供的雷帕霉素的纯化方法包括：在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；将所述滤液过活性炭柱，得到第一中间产物；用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。此方法通过活性炭吸附/解吸附-高效逆流色谱分离雷帕霉素，具有工艺操作性强，产品纯度高，收率高，适合在工业规模上生产等优点。附图说明图1为本专利技术中实施例1中纯化雷帕霉素和雷帕霉素标准品的高效液相色谱图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种雷帕霉素的纯化方法，包括：步骤S11，在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；步骤S12，将所述滤液过活性炭柱，得到第一中间产物；步骤S13，用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；步骤S14，用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；步骤S15，将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。进一步地，在步骤S11中，所述第一温度为35-42℃，例如可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，优选为40℃。当温度过低时，溶出效果不好，当温度过高时，有机溶剂会挥发。雷帕霉素发酵液体积与第一有机溶剂的体积比为1:1-1:2，例如可以为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:2等。当雷帕霉素发酵液体积与第一有机溶剂的体积比过大时，雷帕霉素的溶解率不高，当雷帕霉素发酵液体积与第一有机溶剂的体积比过小时，会导致有机溶剂的体积过大，有机溶剂过大会增加后续处理问题，导致环境污染等问题。抽提时间为2-4小时，例如可以为2、2.5、3、3.5、4等，优选为2小时。当抽提时间过小时，溶出效果不好，当抽提时间过大时，会增大能耗，从而会增大抽提的成本。第一溶剂为乙醇或丙酮，优选为乙醇，当乙醇作溶剂时，得到的纯化雷帕霉素的纯度最高。进一步地，步骤S12包括：将活性炭加入滤液中，搅拌吸附后，过过滤器得到第一中间产物，所述第一中间产物为活性炭滤饼。活性炭的质量与滤液的体积比为1:50-1:100g/mL，例如可以为1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100。当比值活性炭的质量与滤液的体积比过大时，会增加后续有机溶剂的用量，当比值活性炭的质量与滤液的体积比过小时，吸附不完全。搅拌吸附的时间为1-5小时，例如可以为1、1.5、2、2.5、3、4、5，优选为1小时。当吸附时间过小时，吸附不完全，吸附1小时吸附值大于95％，随着时间的增加吸附量几乎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雷帕霉素的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括：/n在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；/n将活性炭加入滤液中，得到第一中间产物；/n用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；/n用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；/n将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。/n

【技术特征摘要】
1.一种雷帕霉素的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括：
在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；
将活性炭加入滤液中，得到第一中间产物；
用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；
用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；
将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。


2.如权利要求1所述的雷帕霉素的纯化方法，其特征在于，所述第一温度为35-42℃。


3.如权利要求1所述的雷帕霉素的纯化方法，其特征在于，所述第一溶剂为乙醇或丙酮；
和/或，所述第二溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种；
和/或，所述第三溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。


4.如权利要求1所述的雷帕霉素的纯化方法，其特征在于，所述在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液步骤中，抽提时间为2-4小时。


5.如权利要求1所述的雷帕霉素的纯化方法，其特征在于，所述雷帕霉素发酵液体积与所述第一有机溶剂的体积比为1:1-1:...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘飞，张晓元，张艳艳，郝荣华，陈勉，张林军，张金华，袁超，张秀华，袁丹丹，刘霞，凌沛学，
申请(专利权)人：山东省药学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37