一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)样品前处理：将尿液样品酸化后过滤；(b)配制标准溶液；(c)高效液相色谱测定：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇和0.5％的(乙酸+磷酸)混合液，洗脱方式为梯度洗脱；(d)根据所述标准溶液经色谱系统获得的标准曲线的线性回归方程以及所述尿液样品的峰面积，计算得出所述尿液样品中各代谢产物的浓度。本发明专利技术建立的方法样品前处理过程简单，通过色谱柱和洗脱条件的选择优化，能在30分钟内完成一次检测，并且能够同时检测分析多种BTEX代谢产物，操作简单，分离效果好，具有良好的准确度和精密度和回收率。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法
本专利技术涉及生物分析与检测
，尤其是涉及一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法。
技术介绍
BTEX一般指苯系物，是苯的衍生物的总称，主要包括苯、甲苯、乙苯、二甲苯、苯乙烯等，广泛存在于石油、加油站、塑料制品以及工业副产物中。BTEX具有高致癌风险且对生物体具有毒性，被国际癌症组织(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)列为重点关注物质。BTEX的人体暴露途径通常有三种：呼吸、摄入和皮肤接触，其中呼吸暴露是最主要的暴露途径。生活环境中接触BTEX的主要来源包括汽车尾气、汽油挥发以及有机物燃烧等，职业环境中BTEX接触主要为油漆工、鞋厂以及石化工人等。BTEX的健康风险包括短期大剂量接触引起的中枢神经系统麻醉和长期接触引起的造血系统毒性和癌症。欧美国家推荐1ppm作为BTEX的8h职业接触限值，我国也于2002年将BTEX的时间加权平均容许浓度修订为6mg/m3。目前部分职业人群接触BTEX的接触水平以ppb级为主，而普通人群日常也存在1-20ppb的BTEX接触。低剂量的BTEX的接触现状使得在使用传统的外暴露量进行风险评估结果可靠性较差。生物检测可反映人体暴露的真实风险，通过对生物样本(如血液、尿液、肺泡等)中的生物标志物检测，能有效的反映个体样本中污染物的负荷程度。尿液在采集过程中具有对受试者无伤害、易获取等特点，是生物检测的主要手段。生物标志物是判断职业暴露水平的生化指标，可用于评价外源化学物的接触水平及其引起的有害生物效应。已有针对人体生物标志物进行的研究表明，反,反式黏康酸(t,t-MA)可作为苯接触的生物标志物；马尿酸可作为甲苯的生物标志物；苯乙醇酸和苯乙醛酸可作为乙苯和苯乙烯的接触生物标志物；甲基马尿酸可作为二甲苯的接触生物标志物。BTEX尿液生物标志物常用检测方法包括分光光度法、气相色谱法以及高效液相色谱法(HPLC)。分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度进行定性和定量分析的方法。汪家兴(1990)采用分光光度法测定尿样中马尿酸浓度，该法最低检测浓度为6mg/L；但在实验过程中由于日光对马尿酸反应产物有破坏作用，操作不当会影响显色效果，重复性较低。气相色谱法是以气体为流动相，根据物质在流动相和固定相中的分配系数差异对样品物质进行分离，该法检测精度较高但样品前处理操作繁琐，普及性差。高效液相色谱法不受样品挥发度和热稳定性的限值，具有高效、方便等优点是目前实验室采用的主要检测手段。对于尿液中BTEX代谢产物的检测，目前HPLC可实现的多为某种代谢产物的单独测定，而在实际环境中BTEX往往同时存在，如何同步测定尿中BTEX的代谢产物，构建快速高效的检测方法是亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法，所述方法能够同时且快速检测分析多种BTEX代谢产物，操作简单、成本低廉、分离效果好。为实现上述目的，本专利技术提供了一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)样品前处理：将尿液样品酸化后过滤；(b)配制反,反式黏康酸、马尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸以及甲基马尿酸的标准溶液；(c)高效液相色谱测定：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇和0.5％(乙酸+磷酸)混合液，洗脱方式为梯度洗脱；(d)根据所述标准溶液经色谱系统获得的标准曲线的线性回归方程以及所述尿液样品的峰面积，计算得出所述尿液样品中各代谢产物的浓度。在一个实施方案中，在步骤(a)中，所述尿液样品为尿液比重为1.010-1.030的样品。在本专利技术的一个具体实施方案中，尿液样品采集后及时在实验室进行尿液比重进行测量，将尿液比重位于1.010-1.030的样品选取为有效尿液样品。在本专利技术的一个实施方案中，在步骤(a)中，所述酸化采用盐酸缓冲液，优选地，所述盐酸缓冲液为浓盐酸与水体积比1:1的缓冲液；更优选地，所述酸化时间为10min以上；所述尿液样品的体积为缓冲液体积的50-150倍，更优选100倍；酸化后的样品通过滤膜过滤，优选0.22μm滤膜。在本专利技术的一个具体实施方案中，将待测有效样品置于离心管中，添加盐酸缓冲液混匀，将酸化后样品通过0.22μm滤膜过滤，置于棕色样品瓶中备用。在本专利技术的一个实施方案中，在步骤(c)中，所述C18色谱柱采用TC-C18反向色谱柱；柱温为32-35℃，优选32℃。色谱柱的填料为活性炭。在本专利技术的一个实施方案中，在步骤(c)中，在所述高效液相色谱中洗脱方式为进行梯度洗脱，所述流动相为甲醇和0.5％的(乙酸+磷酸)混合液；样品进样量为1-10μL，优选10μL；流动相流速为0.5-1mL/min，优选地为1mL/min。在本专利技术的一个实施方案中，所述梯度洗脱的程序为：0-3min，甲醇20％，乙酸+磷酸混合液80％；3-12min，甲醇20％，乙酸+磷酸混合液80％；12-22min，甲醇40％，乙酸+磷酸混合液60％；22-25min，甲醇80％，乙酸+磷酸混合液20％；25-26min，甲醇80％，乙酸+磷酸混合液20％；26min，甲醇20％，乙酸+磷酸混合液80％。在本专利技术的一个实施方案中，在步骤(c)中，所述高效液相色谱采用通用型紫外检测器，紫外灯检测波长为237nm。在本专利技术的一个实施方案中，所述标准溶液的配制方法为：利用甲醇溶解反,反式黏康酸，利用去离子水溶解马尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸、甲基马尿酸标准品，并稀释成1、5、10、20、40、80mg/mL的标准溶液。在本专利技术的一个具体实施方案中，分别称取反,反式黏康酸、马尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸以及甲基马尿酸标准样品溶解于去离子水中(其中反,反式黏康酸溶解于甲醇中)配制标准贮备液，再将贮备液浓度稀释配制成1、5、10、20、40、80mg/mL的标准溶液。在本专利技术的一个实施方案中，所述甲基马尿酸包括2-甲基马尿酸、3-甲基马尿酸和4-甲基马尿酸。在本专利技术的一个实施方案中，步骤(a)中，所述有效样品的体积为5-15mL，优选为10mL。对于使用液相色谱方法同时测定多种不同代谢产物的方案，样品的前处理过程与色谱分离条件的最优化是最关键的因素。很多色谱分离方法中难以将不同的成分有效分离，分离度达不到要求很大程度上与样品的处理以及色谱过程中的条件设置有关。在本申请的实施方案中，申请人在研究中发现前处理过程中若采用有机提取溶剂进行复杂的萃取过程，反而会导致BTEX代谢产物最终的回收率差。本申请方案直接采用酸化和过滤的前处理方法，简单省时，且后续分离效果良好。本申请实施方案中，色谱条件包括尤其是流动相的配比、梯度洗脱程序和柱温是从大量实验中不断摸索获得，在本专利技术技术方案的条件下，代谢产物溶解性良好并且保留时间得到了最佳优化。经过梯度洗脱后，目标物在色谱柱上的保留能力良好，色谱峰形对称性良本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(a)样品前处理：将尿液样品酸化后过滤；/n(b)配制反,反式黏康酸、马尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸以及甲基马尿酸的标准溶液；/n(c)高效液相色谱测定：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇和0.5％的(乙酸+磷酸)混合液，洗脱方式为梯度洗脱；/n(d)根据所述标准溶液经色谱系统获得的标准曲线的线性回归方程以及所述尿液样品的峰面积，计算得出所述尿液样品中各代谢产物的浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测尿液中BTEX代谢产物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)样品前处理：将尿液样品酸化后过滤；
(b)配制反,反式黏康酸、马尿酸、苯乙醇酸、苯乙醛酸以及甲基马尿酸的标准溶液；
(c)高效液相色谱测定：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇和0.5％的(乙酸+磷酸)混合液，洗脱方式为梯度洗脱；
(d)根据所述标准溶液经色谱系统获得的标准曲线的线性回归方程以及所述尿液样品的峰面积，计算得出所述尿液样品中各代谢产物的浓度。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述尿液样品为尿液比重为1.010-1.030的样品。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述酸化采用盐酸缓冲液，优选地，所述盐酸缓冲液为浓盐酸与水体积比1:1的缓冲液；更优选地，所述酸化时间为10min以上；所述尿液样品的体积为缓冲液体积的50-150倍，更优选100倍；酸化后的样品通过滤膜过滤，优选0.22μm滤膜。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述C18色谱柱采用TC-C18反向色谱柱；柱温为32-35℃，优选32℃。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述样品进样量为1-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘彦君，杨惠媛，陆文静，王前，
申请(专利权)人：中国矿业大学北京，
类型：发明
国别省市：北京;11