一种新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型鲐鱼抗炎活性肽，氨基酸序列为HGTLVMR，属于生物技术领域，通过采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶的一种或混合得到鲐鱼活性肽，通过超滤分离、凝胶层析分离、RP‑HPLC分离并对凝胶层析分离组分及RP‑HPLC分离组分进行抗炎测试，最终得到高活性的单一鲐鱼抗炎活性肽。本发明专利技术得到的高抗炎活性的新型鲐鱼抗炎活性肽氨基酸序列为HGTLVMR，对环氧化酶COX‑2起抑制作用，抑制率至少达到了60％，抗炎效果好，同时，对细胞有促进作用，细胞存活率高，细胞存活率至少达到了140％。

【技术实现步骤摘要】
一种新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法。
技术介绍
海洋中的资源丰富，物种繁多，海洋生物物种占地球生物的80％以上，是具有生物活性的天然分子的巨大储存库，能够为天然活性物质提供丰富的物质来源。与陆地生物相比，海洋生物具有多样性、复杂性和特殊性，这就使得海洋天然产物在生长和代谢过程中，产生不同于陆地生物的具有特殊生理功能的活性物质。鲐鱼，鲈形科，鲭科，鲐属。体型粗壮，是海洋中上层鱼类。鲐鱼产量高，在我国各海域均有分布，尤以黄海海域和东海海域分布最广泛，此外，鲐鱼在日本海域等也均有分布，是北太平洋重要的经济鱼类之一。由于天然存在于鲐鱼中的活性肽含量较少，提取困难，人工合成成本高，因此，从鲐鱼蛋白酶解产物中寻找生物活性肽成为人类利用鲐鱼的重要途径。蛋白酶水解法是水解蛋白质分子以制备生物活性肽的一种常用方法，酶水解法因为具有反应条件温和，成本较低，安全性高等优点而备受关注。酶水解法过程中需要对酶解时间、酶解温度、pH值、液固比和加酶量等反应条件进行优化，酶水解法中常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白么和胃蛋白酶等，酶类的选择尤为重要，不同的蛋白酶因为酶切位点和反应条件不同，即使酶解同一种蛋白质分子，得到的多肽数目和序列也相差很大。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种具有促进细胞生长的、抑制环氧化酶COX-2的、可用于抗炎药物中的新型鲐鱼抗炎活性肽，包含氨基酸序列为HGTLVMR的鲐鱼活性肽。氨基酸序列为HGTLVMR的鲐鱼活性肽抑制了环氧化酶COX-2，促进淋巴细胞、巨噬细胞生成速度加快，清除坏死细胞，同时促进细胞再生，从而增加机体对外界不同因素的抵抗能力和催生细胞增殖，促进伤口愈合、身体康复，从而增强体质、免疫能力、调节气血的作用，有效地修复炎症带来的组织损伤，消除红肿，使得炎症患者能够快速康复。本专利技术的另一个目的在于提供一种高抗炎活性的、酶解效果好的新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法，包括：将鲐鱼进行预处理工序得到预处理鲐鱼鱼糜；将预处理鲐鱼鱼糜进行酶解工序得到鲐鱼酶解液；将鲐鱼酶解液进行分离纯化工序得到鲐鱼抗炎活性肽，鲐鱼抗炎活性肽包含氨基酸序列为HGTLVMR的鲐鱼活性肽。优选地，将鲐鱼去头和内脏，洗净血水，搅成鱼糜，于0.05-1wt％的碳酸氢钠溶液中浸泡1-6h进行脱脂，去除溶液得到预处理鲐鱼鱼糜。优选地，酶解工序中，将预处理鲐鱼鱼糜与去离子水混合，调节pH6-8，加入蛋白酶，在30-60℃的温度下酶解2-12h，酶解完毕后煮沸灭酶5-30min，冷却，离心，取上清液得到鲐鱼酶解液；去离子水的添加量为鲐鱼鱼糜的5-30wt％。更优选地，蛋白酶的添加量为鲐鱼鱼糜的1-5wt％，蛋白酶可以为单一蛋白酶或混合蛋白酶，单一蛋白酶分别为：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶，混合蛋白酶为单一蛋白酶2-4种的混合。更进一步优选地，混合蛋白酶为四种单一蛋白酶的混合，其中，胰蛋白酶的质量分数为15-23wt％，木瓜蛋白酶的质量分数为2-10wt％，风味蛋白酶的质量分数为40-48wt％，中性蛋白酶的质量分数为35-43wt％。优选地，酶解工序中还可以加入2-(四氢糠氧基)四氢吡喃和亚氨基二乙酸，2-(四氢糠氧基)四氢吡喃的添加量为鲐鱼鱼糜的0.5-3wt％，亚氨基二乙酸的添加量为鲐鱼鱼糜的0.1-3wt％；2-(四氢糠氧基)四氢吡喃和亚氨基二乙酸在酶解过程中，刺激蛋白酶并提高对肽键的识别效率，同时2-(四氢糠氧基)四氢吡喃和亚氨基二乙酸在溶液中与酶解底物相互作用，使肽键更大概率暴露，降低水解的困难程度，促进蛋白酶对鲐鱼的水解，在同样的时间内得到更小分子量的多肽，提高水解度，提高小分子肽的含量。优选地，分离纯化工序包括：超滤膜分离、凝胶层析分离和RP-HPLC分离。更优选地，分离纯化工序中，先采用超滤膜对鲐鱼酶解液进行超滤处理，将鲐鱼酶解液经1KDa超滤膜超滤，收集<1KDa分子量段的超滤液。更优选地，分离纯化工序中，将<1KDa分子量段的超滤液用凝胶层析柱分离得到层析分离鲐鱼活性肽溶液。更优选地，分离纯化工序中，超滤后，采用凝胶层析分离处理：将<1KDa分子量段的超滤液用凝胶层析柱分离得到不同组分的同一吸收峰鲐鱼活性肽溶液，检测抗炎活性并保留得到活性最高的鲐鱼活性肽组分。更优选地，分离纯化工序中，层析分离后，采用RP-HPLC进行处理，将层析分离后得到活性最高的鲐鱼活性肽组分用RP-HPLC进行分离，将属于同一峰的收集液混合，除去乙腈和三氟乙酸，检测抗炎活性并保留得到活性最高的鲐鱼活性肽单一组分，冻干后得到鲐鱼抗炎肽单一组分。更优选地，流动相为A相和B相的混合液，A相为乙腈，B相为三氟乙酸水溶液，其中，乙腈的体积分数添加量为1-60％，三氟乙酸水溶液的添加量为99-40％，三氟乙酸溶液的质量分数为0.01-0.5wt％。更优选地，在0-10min内采用的流动相中A和B的体积分数分别为1-5％和99-95％。更优选地，在10-15min内采用的流动相中A和B的体积分数别为10-30％和70-90％。更优选地，在15-25min内采用的流动相中A和B的体积分数别为30-45％和55-70％。更优选地，在25-30min内采用的流动相中A和B的体积分数别为45-60％和40-55％。更优选地，流速为1-10mL/min。本专利技术由于采用了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶的混合酶解，因而具有如下有益效果：分子量小于3kDa的鲐鱼活性肽达到了95％以上，分子量小于1kDa的鲐鱼活性肽达到了70％以上，水解度达到了20％以上，抗炎效果好，其中得到的氨基酸序列为HGTLVMR的鲐鱼活性肽对环氧化酶COX-2起抑制作用，抑制率至少达到了60％，细胞存活率高，细胞存活率至少达到了140％。因此，本专利技术是一种高抗炎活性的、酶解效果好的新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法。附图说明图1为单一蛋白酶与混合蛋白酶对鲐鱼的水解度图；图2为不同比例的混合蛋白酶的水解度图；图3为添加剂对混合蛋白酶的水解度的影响图；图4为凝胶层析分离鲐鱼活性肽图；图5为凝胶层析分离鲐鱼活性肽抗炎层析图；图6为RP-HPLC分离凝胶层析分离鲐鱼活性肽组分3色谱图；图7为RP-HPLC分离单一鲐鱼活性肽抗炎图；图8为RP-HPLC分离单一鲐鱼活性肽的细胞存活率图。具体实施方式以下结合具体实施方式和附图对本专利技术的技术方案作进一步详细描述：实施例1：一种鲐鱼酶解液的制备方法，将鲐鱼去头和内脏，洗净血水，搅成鱼糜，于0.1wt％的碳酸氢钠溶液中浸泡3h进行脱脂，去除溶液得到预处理鲐鱼鱼糜。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型鲐鱼抗炎活性肽，其氨基酸序列为HGTLVMR。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型鲐鱼抗炎活性肽，其氨基酸序列为HGTLVMR。


2.根据权利要求1所述的一种新型鲐鱼抗炎活性肽，其特征是：所述鲐鱼抗炎活性肽具有促进细胞生长的功能。


3.根据权利要求1所述的一种新型鲐鱼抗炎活性肽，其特征是：所述鲐鱼抗炎活性肽具有抑制环氧化酶COX-2的性质。


4.权利要求1-3任一所述的一种新型鲐鱼抗炎活性肽在抗炎药物中的用途。


5.权利要求1所述的一种新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法，包括：将鲐鱼进行预处理工序得到预处理鲐鱼鱼糜；将预处理鲐鱼鱼糜进行酶解工序得到鲐鱼酶解液；将鲐鱼酶解液进行分离纯化工序得到鲐鱼抗炎活性肽，所述鲐鱼抗炎活性肽包含氨基酸序列为HGTLVMR。


6.根据权利要求5所述的一种新型鲐鱼抗炎活性肽的制备方法，其特征是：所述酶解工序中采用的...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：杭州鹿扬科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33