人乳头瘤病毒16型表位嵌合L1的重组载体、重组蛋白、病毒样颗粒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术构建了含有人乳头瘤病毒16型表位嵌合DNA片段的病毒样颗粒系统，首先将含有人乳头瘤病毒16型E7

【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒16型表位嵌合L1的重组载体、重组蛋白、病毒样颗粒及其制备和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及含有人乳头瘤病毒16型表位嵌合L1的重组载体、重组蛋白、病毒样颗粒及其制备和应用。
技术介绍
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率居女性恶性肿瘤第二位,且发病逐渐趋于年轻化。据世卫组织报道，2018年全球宫颈癌新发病例57万，死亡人数31.1万,严重危害女性健康。目前宫颈癌预防性疫苗的研究较成功，国际上市的HPV疫苗分别是默沙东公司生产的四价疫苗佳达修-4(Gardasil-4)和九价疫苗佳达修-9(Gardasil-9)，以及葛兰素史克公司的二价疫苗希瑞适(Cervarix)，三种疫苗均是以体外表达的HPVL1衣壳蛋白自组装成VLPs为有效抗原，混合佐剂诱导机体产生中和抗体。此类疫苗能有效预防高危型HPV病毒感染，但对已经感染HPV的人群无效。人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染是诱发女性宫颈癌的主要原因。已知发现的HPV亚型达200多种，其中HPV16和18型属于高危型中最易致癌型，超过70％的宫颈癌病变由此导致。HPV疫苗是控制宫颈癌的有效手段之一。HPV的主要衣壳蛋白L1可以单独表达并自组装成病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)。VLPs与天然病毒的结构高度相似，将其免疫机体后可刺激产生高滴度的中和抗体，目前，利用VLPs研制的HPV预防性疫苗已用于临床。但是，此类疫苗诱导机体产生的细胞免疫应答较弱。HPV基因组的早期转录区(E区)编码的E7蛋白是导致细胞发生恶性转化的关键。E749-57表位能诱导T淋巴细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术的专利技术目的之一是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段。本专利技术的专利技术目的之二是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体。本专利技术的专利技术目的之三是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体的构建方法。本专利技术的专利技术目的之四是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的重组蛋白。本专利技术的专利技术目的之五是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1重组蛋白的构建方法。本专利技术的专利技术目的之六是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的病毒样颗粒。本专利技术的专利技术目的之七是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的病毒样颗粒的制备方法。本专利技术的专利技术目的之八是提供了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的病毒样颗粒在制备人乳头瘤病毒疫苗的应用。本专利技术提供的技术方案为：含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQIDNO.1所示。含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体，包括载体和基因片段HPV16L1-E749-57；其中，所述基因片段HPV16L1-E749-57含有如SEQIDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。优选的是，所述载体为质粒pET28a。含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体的构建方法，包括：以pGEM-Teasy-16L1-E749-57为模板，利用SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pET-28a质粒上以得到重组质粒pET28a-16L1-E749-57。含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的重组蛋白，包括含有由SEQIDNO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的重组蛋白的构建方法，使用所述的含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体，包括如下过程：将所述重组质粒pET28a-16L1-E749-57转入大肠杆菌BL21中，培养后收集菌体并纯化得到重组蛋白；其中，所述重组蛋白含有由SEQIDNO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的病毒样颗粒，包括含有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的病毒样颗粒的制备方法，使用所述的重组蛋白，包括：向所述重组蛋白中加入还原剂作用后，在组装液中透析后得到自组装的病毒样颗粒。使用所述的含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的病毒样颗粒在制备人乳头瘤病毒疫苗的应用。本专利技术与现有技术相比较所具有的有益效果：将优势CTL表位E749-57嵌入该位点，形成的VLPs粒径均一，形态饱满，稳定性好，与野生型VLPs相似度高，这样的结构对激发机体免疫应答极为重要。构建HPV16L1-E749-57基因突变体后利用大肠杆菌进行表达，成本低廉，VLPs得率较高，嵌合型VLPs免疫小鼠后，能激发小鼠体液免疫反应产生中和抗体，产生较强的细胞免疫应答。附图说明图1a、1b为本专利技术所述的最佳嵌合位点预测示意图。图2为本专利技术所述的重组质粒pET28a-16L1-E749-57的PCR鉴定示意图。图3为本专利技术所述的HPV16L1-E749-57蛋白表达的SDS-PAGE分析示意图。图4为本专利技术所述的HPV16L1-E749-57蛋白可溶性鉴定示意图。图5为本专利技术所述的HPV16L1-E749-57蛋白纯化的SDS-PAGE分析示意图。图6为本专利技术所述的HPV16L1-E749-57蛋白纯化的Westernblot分析示意图。图7为本专利技术所述的E749-57嵌合VLPs粒径分析示意图。图8为本专利技术所述的E749-57嵌合VLPs的电镜观察示意图。图9为本专利技术所述的免疫血清中和试验示意图。图10a～10c为本专利技术所述的Th1型细胞因子水平检测示意图。图10d～10f为本专利技术所述的Th2型细胞因子水平检测示意图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术构建了含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的病毒样颗粒，首先将含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段连接在质粒pET28a上构建重组质粒pET28a-16L1-E749-57，然后将其转入大肠杆菌中进行培养得到重组蛋白，进而进行自组装得到病毒样颗粒(VLPs)；组装后的病毒样颗粒能够同时刺激小鼠产生体液和细胞免疫应答。本专利技术中的“重组载体”是指已连接了基因的表达载体，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。...

【技术保护点】
1.含有人乳头瘤病毒16型E7

【技术特征摘要】
1.含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的序列如SEQIDNO.1所示。


2.含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体，其特征在于，包括载体和基因片段HPV16L1-E749-57；
其中，所述基因片段HPV16L1-E749-57含有如SEQIDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。


3.如权利要求2所述的含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体，其特征在于，所述载体为质粒pET28a。


4.含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1DNA片段的重组载体的构建方法，其特征在于，包括：
以pGEM-Teasy-16L1-E749-57为模板，利用SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pET-28a质粒上以得到重组质粒pET28a-16L1-E749-57。


5.含有人乳头瘤病毒16型E749-57表位嵌合L1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘微，孙美艳，郭健，张磊，许会静，王皓，
申请(专利权)人：吉林医药学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22