一种诱导里氏木霉产纤维素酶的方法技术

本发明专利技术公开一种促进里氏木霉产纤维素酶的方法，所述方法包括里氏木霉发酵24‑36h后，检测发酵液溶氧为1.5‑2.0mg/mL且有继续下降趋势时流加复合型诱导碳源，所述复合型诱导碳源是秸秆木质纤维素酶解液与葡萄糖酶解液按照3:7‑9的质量比例混合得到。本发明专利技术所述的流加方法可程序化设定，节省人力物力，且所述流加方式相较于匀速补加方法更符合里氏木霉生长和繁殖规律，有利于纤维素酶的生产。另外，本发明专利技术对秸秆进行预处理，不仅能增加秸秆汽爆程度,而且能去除秸秆中影响酶解效率的难挥发性物质，有效提高秸秆作为非可溶性碳源的酶解效率。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导里氏木霉产纤维素酶的方法
本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一种通过流加碳源诱导里氏木霉产纤维素酶的方法。
技术介绍
如今人口数量的持续增长，世界正面临着食物、饲料、化学品和能源供应等各方面的危机，寻求新的可再生能源已经是全世界高度关注的领域。木质纤维素是自然界中廉价的可再生生物质材料，具有总量大、价格低、绿色环保等特点。木质纤维素材料通过纤维素降解酶的协同作用够被降解为糖类，在生物工程工业化生产中，糖可以作为基础原料，通过微生物的发酵作用转化成乙醇、乳酸和氢气等具有高附加值的化学产品，木质纤维素生物质在未来有望替代石油成为生产燃料和化学品的重要可再生原料。但目前我国利用木质纤维素生物质的生物炼制产业仍存在产量低、成本高的问题，主要原因在于纤维素酶的成本过高，约占整个产业成本的25-30％。因此，开发低成本、高酶活的纤维素酶是生物炼制产业工业化生产的首要任务。现阶段，里氏木霉RUT-C30是应用最为广泛的纤维素酶生产菌株之一。已经有确切的研究证据表明，合适的培养条件的改变能够显著提高里氏木霉发酵产纤维素酶的酶活，其中碳水化合物及其衍生物在诱导纤维素酶基因的表达中有重要作用。里氏木霉产纤维素酶的诱导物主要可分为两类，一类是以木质纤维素和微晶纤维素为代表的不溶性诱导物，另一类是以纤维二糖、乳糖和槐糖等寡糖类物质为代表的可溶性诱导物。其中，微晶纤维素和槐糖等诱导物成本较高，不适合工业生产中大量添加。因此，选择合适的诱导碳源是促进里氏木霉高产纤维素酶的重中之重。专利文献CN201510962762.4公开了一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用，通过非可溶性碳源进行发酵，采用还原糖控制措施，降低碳水化合物的阻遏效应，提高纤维素酶生产能力。所述生产方法具体包括：以里氏木霉或草酸青霉为纤维素酶生产菌进行发酵，整个发酵期间pH始终维持在3.5-6.5之间，发酵至48-60h，开始补料，补料后控制还原糖含量≤2.5mg/mL，每4-5h为一补料速率调整阶段，至结束发酵。所述补料培养基为：葡萄糖母液或木糖母液与硫酸镁、硫酸锌的混合液。专利文献CN201010040047.2公开了一种生产纤维素酶的方法，包括：将里氏木霉接种至发酵培养基中，发酵60-90小时后开始流加培养，流加培养过程中，当发酵液pH值高于4.8时流加培养基，当发酵液pH值低于4.5时停止流加培养基，总发酵时间达到192-240小时，停止发酵。所述方法将不溶性碳源和可溶性碳源有机结合，协同诱导纤维素酶基因的表达。所述不溶性碳源为纤维素粉、纸浆和经过蒸汽爆破的植物纤维素原料中的至少一种，所述可溶性碳源由87-94％的葡萄糖和6-13％的槐糖组成。专利文献CN201810076624.X公开了一种利用纯秸秆固体补料诱导里氏木霉产纤维素酶的方法，包括如下步骤：S1、平板培养；S2、种子罐培养；S3、发酵培养：在接种后的产酶培养过程中，当产酶发酵罐内PH值降至4.5时，用氨水调控PH使其不低于4.5，当pH第二次下降后、开始回升时进行补料；或者，当发酵罐内溶氧饱和度第一次开始回升时进行补料。上述现有技术均公开了前期以非可溶性碳源如秸秆、麸皮等作为初始碳源，但后期发酵补料培养基中均添加有可溶性糖类如葡萄糖、槐糖等作为补充碳源。实际上，本申请的专利技术人发现，后期补充碳源的选择、添加时间及添加方式都是影响里氏木霉产纤维素酶的重要因素。
技术实现思路
在上述背景的基础上，本专利技术的目的是提供一种诱导里氏木霉产纤维素酶的方法，具体的，利用非可溶性碳源和可溶性碳源混合发酵，通过优化补充碳源诱导里氏木霉高产纤维素酶，优选，通过调控补充碳源的补料速度和补料量，降低生产纤维素酶的时间成本和经济成本，且以此方法生产的纤维素酶，酶系组成完整活力高。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：第一方面，本专利技术提供一种促进里氏木霉产纤维素酶的方法，所述方法包括在里氏木霉发酵阶段发酵24-36h后，检测发酵液溶氧为1.5-2.0mg/mL且有继续下降趋势时流加复合型诱导碳源，所述复合型诱导碳源是秸秆木质纤维素酶解液与葡萄糖酶解液按照2-6:(8-4)的质量比例混合得到，优选，以秸秆木质纤维素酶解液与葡萄糖酶解液的总质量为100份计，秸秆木质纤维素酶解液占20-50份，最优选30-40份。所述秸秆木质纤维素酶解液的制备方法为：将20-25％(w/v)经蒸汽爆破预处理的秸秆材料溶解于里氏木霉不加复合型诱导碳源发酵的粗酶液中，50-60℃、pH4.8-5.0、180-200rpm条件下反应20-24h得到。所述经蒸汽爆破预处理的秸秆材料是将秸秆粉碎至1-2cm的粗粒，与水按1:1-1.5的比例混合后投入汽爆罐中，加热至185-195℃，维持10-20min后瞬间释放压力，降温后取出压榨、烘干、粉碎得到。所述葡萄糖酶解液的制备方法为：使用50-60％(w/v)的葡萄糖溶液，添加20-25CBU/g的β-葡萄糖苷酶，60-65℃、pH4.8-5.0、180-200rpm的条件下反应20-24h得到。本专利技术所述的复合型诱导碳源的补加量是里氏木霉发酵培养基中基础碳源质量的50-60％。所述复合型诱导碳源流加补料方式为：24-36h匀速流加11-14％诱导碳源，36-48h匀速流加15-17％诱导碳源，48-60h匀速流加15-20％诱导碳源，60-72h匀速流加20-24％诱导碳源，72-84h匀速流加15-16％诱导碳源，84-96h匀速流加10-12％诱导碳源。经过专利技术人长期实验发现，最优选的复合型诱导碳源流加补料方式为：24-36h匀速流加12％诱导碳源，36-48h匀速流加16％诱导碳源，48-60h匀速流加20％诱导碳源，60-72h匀速流加24％诱导碳源，72-84h匀速流加16％诱导碳源，84-96h匀速流加12％诱导碳源。本专利技术优化得到的复合型诱导碳源流加补料方式完全可以设置程序化补料方式，不仅节省人力物力，而且可以实现比较精确定量，与匀速流加复合型诱导碳源的方式相比更加符合里氏木霉生长和繁殖规律，更有利于纤维素酶的生产。在本专利技术的优选实施方式中，所述促进里氏木霉产纤维素酶的方法具体包括如下步骤：(1)里氏木霉培养皿培养：将里氏木霉种子液加到培养基平板上，每个培养皿中接种孢子总数为1×105-1×106个，在温度30-32℃、湿度60-65％的培养箱中培养5-7天，待绿色绒状孢子布满整个平板后向培养皿中加超纯水，刮下菌丝和孢子，4℃保存；(2)里氏木霉种子罐培养：将步骤(1)保存的孢子液接种至种子罐中，使孢子浓度为1×109-1×1010个/L，种子罐转速180-200rpm/min，通气量1-1.5vvm，常温下培养20-24小时，期间通过流加2MNaOH溶液控制培养基pH为4.8-5.0；(3)里氏木霉发酵培养：将步骤(2)的里氏木霉种子液接入发酵罐中，控制发酵罐转速为180-350rpm/min，通气量1-1.5vvm，使发酵液溶氧在1.2-3.5mg/L，期间通过流加10％的氨水控本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进里氏木霉产纤维素酶的方法，所述方法包括里氏木霉发酵24-36h后，检测发酵液溶氧为1.5-2.0mg/mL且有继续下降趋势时流加复合型诱导碳源，所述复合型诱导碳源是秸秆木质纤维素酶解液与葡萄糖酶解液按照2-6:(8-4)的质量比例混合得到，优选，以秸秆木质纤维素酶解液与葡萄糖酶解液的总质量为100份计，秸秆木质纤维素酶解液占20-50份。/n

【技术特征摘要】
1.一种促进里氏木霉产纤维素酶的方法，所述方法包括里氏木霉发酵24-36h后，检测发酵液溶氧为1.5-2.0mg/mL且有继续下降趋势时流加复合型诱导碳源，所述复合型诱导碳源是秸秆木质纤维素酶解液与葡萄糖酶解液按照2-6:(8-4)的质量比例混合得到，优选，以秸秆木质纤维素酶解液与葡萄糖酶解液的总质量为100份计，秸秆木质纤维素酶解液占20-50份。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述秸秆木质纤维素酶解液的制备方法为：将20-25％(w/v)经蒸汽爆破预处理的秸秆材料溶解于里氏木霉不加复合型诱导碳源发酵的粗酶液中，50-60℃、pH4.8-5.0、180-200rpm条件下反应20-24h得到；所述葡萄糖酶解液的制备方法为：使用50-60％(w/v)的葡萄糖溶液，添加20-25CBU/g的β-葡萄糖苷酶，60-65℃、pH4.8-5.0、180-200rpm的条件下反应20-24h得到。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合型诱导碳源的补加量是里氏木霉发酵培养基中基础碳源质量的50-60％。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合型诱导碳源流加补料方式为：24-36h匀速流加11-14％诱导碳源，36-48h匀速流加15-17％诱导碳源，48-60h匀速流加15-20％诱导碳源，60-72h匀速流加20-24％诱导碳源，72-84h匀速流加15-16％诱导碳源，84-96h匀速流加10-12％诱导碳源。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述里氏木霉发酵培养基组分如下：3.5-4.5％的非可溶性碳源、1-2％葡萄糖、3-4％产酶大量元素营养盐浓缩液、0.01-0.04％产酶微量元素浓缩液、0.1-0.2％玉米浆，余量为水。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述非可溶性碳源的制备包括如下步骤：
(1)在蒸汽爆破处理前用H2SO4与富马酸的混酸对秸秆进行浸泡处理；
(2)将浸泡之后的秸秆烘干，用酒...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤超，杨锐红，陶程程，
申请(专利权)人：上海汉禾生物新材料科技有限公司，武汉迪因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31