钩藤发根的高效诱导和培养方法技术

本发明专利技术公开了钩藤发根的高效诱导和培养方法，具体方法是将活化的发根农杆菌C58C1用于浸染经预培养的钩藤外植体，然后接种于共培养的培养基上暗培养3d，然后转移至发根诱导培养基上诱导培养；该方法钩藤发根的诱导效率高，为外源基因的遗传转化奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
钩藤发根的高效诱导和培养方法
本专利技术涉及组织培养领域，具体涉及钩藤发根的高效诱导和培养方法。
技术介绍
钩藤(Uncariarhynchophylla)是贵州省地道药材，种植面积广，需求量高，功能清血平肝，息风定惊，用于风热头痛，感冒压惊，惊痛抽搐等症。其药效活性成分为钩藤碱和异构藤碱，有降血压作用，能有效控制多种心血管疾病，广泛应用于医学临床，生产上其含量高低已作为评价钩藤药材品质优劣的标准。近年受心血管的高频率患发，使得市场上对钩藤的应用量及需求量明显上升，实现对钩藤优质品种的选育及钩藤中有效次生代谢物的大规模工业化生产势具有重要的产业意义。发根是发根农杆菌将自身pRi质粒上rol基因整合进植物基因组后诱导细胞产生的分支丰富的毛状根组织，拥有无激素自主生长、生长速度快，无向地性，遗传稳定等特点。同时发根具有和母体植物相同的代谢途径，并往往能合成比母体植物更高水平的次生代谢物。很多药用植物都建立了发根培养体系，用于大规模获取有价值的天然代谢产物，包括银杏、颠茄、丹参、甘草和朱砂根等。发根的诱导本质上是一种农杆菌介导的转基因过程，诱导过程简便，不需要复杂的植物再生程序，且易于培养，借助于T-DNA可携带外源基因整合入植物基因组，所以发根也作为一种高效稳定的遗传转化体系，大量用于外源基因的功能分析，在功能基因组研究中成为一种高效的工具，钩藤目前还未建立植株的遗传转化体系，所以发根的高效诱导对于钩藤活性成分合成的分子机制研究也意义重大。吴顺等报道了钩藤发根的诱导，但是诱导效率经优化后也仅为54％(吴顺等，钩藤毛状根的诱导及其钩藤碱含量的测定，北方园艺，2019)。该方法用于获取发根培养尚可，但如作为外源基因的遗传转化体系，则会由于筛选压的加入使转基因发根阳性率急剧下降。因此，亟需建立最适于钩藤发根生长和活性成分积累的培养基，建立了高效的发根诱导和培养体系。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种钩藤发根的高效诱导和培养方法，为转化外源基因的遗传转化奠定基础。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、钩藤发根的高效诱导和培养方法，包括如下步骤：将活化的发根农杆菌C58C1用于浸染经预培养的钩藤外植体，然后接种于共培养的培养基上暗培养3d，然后转移至发根诱导培养基上诱导培养。优选的，所述预培养为将钩藤的叶或茎剪出伤口接种于预培培养基上暗培养5天，所述预培培养基为WPM+2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA+3g·L-1蔗糖+7.2‰琼脂，pH为5.8-6.0。优选的，所述共培养的培养基为WPM+400mg·L-1头孢克肟+30g·L-1蔗糖+7.2‰琼脂。优选的，所述浸染为将活化的C58C1加入含有浓度为100μmol·L-1乙酰丁香酮的WPM液体培养基使其悬浮，28℃、200r/min摇床中活化培养30min，使发根农杆菌适应WPM培养基；调整菌液OD600＝0.6，然后将预培养的外植体置于活化的菌液中，使发根农杆菌浸染外植体7-8min，倒去菌液，将外植体置于滤纸上，将外植体表面的水分吸干。优选的，所述诱导培养为25℃培养20d，每5d更换一次WPM固体培养基。优选的，所述诱导培养基为WPM+400mg·L-1头孢克肟+30g·L-1蔗糖+7.2‰琼脂。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了钩藤发根的高效诱导和培养方法，通过选择合适的农杆菌和培养基，提高了钩藤发根的诱导效率，为外源基因的遗传转化奠定了基础。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为不同浓度、不同时间的发根数。图2为不同外植体钩藤发根(A.茎；B.嫩叶；C.老叶)。图3为钩藤毛状根基因组PCR扩增(M：DL2000；1：C58C1农杆菌rolB阳性对照；2：C58C1农杆菌rolC阳性对照；3：钩藤组培苗根rolB阴性对照；4：钩藤组培苗根rolC阴性对照；5、6：钩藤发根rolB实验组；7、8：钩藤发根rolC实验组)。图4为不同培养基30d扩大培养。图5为钩藤碱和异钩藤碱的HPLC色谱图(A.标准品；B.样品)。图6为不同培养基中钩藤碱和异钩藤碱含量。图7为不同培养基中生物碱的产量。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。本专利技术中钩藤(Uncariarhynchophylla)种子采于黔东南州丹寨县昌昊金煌有限公司中药材种植基地，在WPM培养基上进行无菌萌发并继代保存无菌苗。发根农杆菌C58C1(pRiA4)保存于贵州大学生化实验室。实施例1、钩藤发根的高效诱导和培养方法钩藤发根的高效诱导和培养方法，包括如下步骤：(1)发根农杆菌C58C1的活化取超低温冰箱中保存的发根农杆菌C58C1划线于YEP固体培养基上(YEP+40mg·L-1利福平+7.2‰琼脂)，28℃，培养24-48h，挑取单菌落接种于50ml选择培养基(YEP+40mg·L-1利福平)，28℃，200r/min摇床培养24h进行第一次活化，之后按照1：50的比例将1ml一活菌液接种于50ml上述选择培养基中，28℃，200r·min-1摇床进行第二次活化培养，测定菌液OD600＝0.4-0.6，收集菌液。(2)菌液浓度及浸染时间的确定将活化农杆菌用生理盐水稀释成5个浓度梯度，其OD600值分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，将叶片浸泡在不同浓度菌液中，将浸泡的时间设置为8min、10min、12min、14min，用滤纸吸干后接种至共转化培养基，每个浓度每个时间接种40片，观察统计转化情况，结果如图1所示。结果显示，不同菌液浓度与不同浸染时间对毛状根诱导率的影响不同。浓度过低，农杆菌的数量少，发根数低，浓度过高，发根数较低。时间过短，农杆菌浸染外植体不充分，发根数低。当农杆菌的浓度OD600＝0.6，时间为14min时，农杆菌的发根数较高。(3)预培养取钩藤无菌苗，选择枝叶丰富的无菌苗(含老、嫩叶、茎)，在超净工作台上将叶片剪成大约2cm2大小的老叶130片、嫩叶110片和大约1cm长的茎25段。接种于预培培养基上(WPM+2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA+3g·L-1蔗糖+7.2‰琼脂，pH为5.8-6.0)，暗培养5d，(4)发根农杆菌诱导浸染将完成二次活化的发根农杆菌离心，弃上清，加入50ml含有乙酰丁香酮(100μmol·L-1)的WPM液体培养基使其悬浮，确保发根农杆菌的全部收集及除去菌液中的其他成分，28℃，200r/min摇床中活化培养30min，使发根农杆菌适应WPM培养基。测定OD值确保发根农杆菌的浓度保持在OD600＝0.6。将预培养的叶片及茎外植体置于活化的菌液中，使发根农杆菌浸染外植体7-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.钩藤发根的高效诱导和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将活化的发根农杆菌C58C1用于浸染经预培养的钩藤外植体，然后接种于共培养的培养基上暗培养3d，然后转移至发根诱导培养基上诱导培养。/n

【技术特征摘要】
1.钩藤发根的高效诱导和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将活化的发根农杆菌C58C1用于浸染经预培养的钩藤外植体，然后接种于共培养的培养基上暗培养3d，然后转移至发根诱导培养基上诱导培养。


2.根据权利要求1所述钩藤发根的高效诱导和培养方法，其特征在于：所述预培养为将钩藤的叶或茎剪出伤口接种于预培培养基上暗培养5天，所述预培培养基为WPM+2mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA+3g·L-1蔗糖+7.2‰琼脂，pH为5.8-6.0。


3.根据权利要求1所述钩藤发根的高效诱导和培养方法，其特征在于：所述共培养的培养基为WPM+400mg·L-1头孢克肟+30g·L-1蔗糖+7.2‰琼脂。


4.根据权利要求1所述钩...

【专利技术属性】
技术研发人员：强玮，张明生，谭艾娟，路星星，付维，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52