血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建制造技术

本发明专利技术公开了血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建，利用CRISPR/Cas9技术在Yap1基因第3外显子两端添加Cre重组酶靶向序列loxP位点，构建条件性基因敲除载体，再进行显微注射的方法制备可用于Yap1基因条件性基因敲除flox小鼠，Yap1

【技术实现步骤摘要】
血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建。
技术介绍
YAP(Yes-associatedprotein，YAP)蛋白是一种调控细胞增殖、分化及凋亡富含脯氨酸的转录共激活子，广泛表达于除外周血白细胞外的各种组织中，由Yap1基因表达。YAP存在多个结构域或特异氨基酸序列，包括N端富含脯氨酸的结构域，转录因子TEADs结合区，WW结构域，SH3结合基序，C端的转录激活域以及PDZ结合基序。YAP是Hippo信号通路下游的主要效应子，其表达水平和功能受该通路的调控。Hippo通路激活后，MST1/2与其衔接蛋白SAV作用，自身磷酸化后激活，导致LATS1/2的磷酸化，LATS1/2继而与其衔接蛋白Mob1，直接磷酸化YAP(127丝氨酸位点)，磷酸化的YAP与14-3-3蛋白结合被滞留在胞浆内，阻止YAP核转运，导致其功能被抑制。一旦Hippo信号通路被抑制，YAP从胞浆转入胞核，结合转录增强子，促进基因转录，调控多种生物学功能。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建，其特征在于，按照以下步骤进行：/n步骤1、制备条件性敲除Yap1基因的同源重组载体：NCK341-VT载体，所述NCK341-VT载体的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示；/n步骤2、根据步骤1得到的NCK341-VT载体构建条件性敲除Yap1基因的flox小鼠；/n步骤3、采用步骤2得到的条件性敲除Yap1基因的flox小鼠构建血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型。/n

【技术特征摘要】
1.血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建，其特征在于，按照以下步骤进行：
步骤1、制备条件性敲除Yap1基因的同源重组载体：NCK341-VT载体，所述NCK341-VT载体的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示；
步骤2、根据步骤1得到的NCK341-VT载体构建条件性敲除Yap1基因的flox小鼠；
步骤3、采用步骤2得到的条件性敲除Yap1基因的flox小鼠构建血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型。


2.根据权利要求1所述的血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建，其特征在于，所述步骤1中NCK341-VT载体通过以下步骤制备：
步骤1.1、以C57BL/6小鼠文库的BAC克隆中RP24-310O18和RP23-53D15为模板，PCR分别扩增C57BL/6小鼠Yap1基因的5’同源臂、cKO和3’同源臂；
步骤1.2、将VB028骨架质粒载体上引入两个LoxP位点和多克隆位点，将如SEQ.NO.1所示的核苷酸序列插入VB028骨架质粒载体上，即得到条件性敲除Yap1基因的NCK341-VT载体。


3.根据权利要求2所述的血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建，其特征在于，选取所述C57BL/6小鼠Yap1基因9号染色体的第3个外显子作为条件敲除区。


4.根据权利要求2所述的血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建，其特征在于，所述步骤2中条件性敲除Yap1基因的flox小鼠的构建方法如下：
步骤2.1、基于CRISPR/Cas9技术，确定C57BL/6J小鼠Yap1基因待敲除的特异性靶位点sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的基因序列如SEQIDNO.2所示，所述sgRNA2的基因序列如SEQIDNO.3所示；
步骤2.2、将步骤2.1得到的sgRNA1、sgRNA2和Cas9核酸酶及同源重组载体利用显微注射方法直接注入C57BL/6小鼠单细胞受精卵的胞浆内...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玉龙，苏兴利，李科，张洪梅，贾敏，秦巧红，鱼跃，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61