一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用，待测样品及特征肽对照品分别溶解制成供试品及对照品溶液，经二硫苏糖醇及碘乙酰胺还原烷基化处理；碳酸氢氨溶液稀释后，加入酶进行水解；酶解结束后，高速离心，取上清液注入液相色谱‑质谱仪进行分析。采用酶解结合液相色谱‑串联质谱‑多反应监测(LC‑MS/MS‑MRM)方法，以三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3作为检测离子对提取离子流色谱图，对注射用白眉蛇毒血凝酶进行种属鉴别。该方法简便快捷，专属性强，填补了注射用白眉蛇毒血凝酶种属来源鉴定的空白，提高了质量控制水平。

【技术实现步骤摘要】
一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用
本专利技术涉及一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用，属于蛇毒血凝酶制品种属鉴定领域。
技术介绍
蛇毒血凝酶类药物是一类来源于不同蛇种的止血药，其主要活性成分蛇毒类血凝酶是一种具有精氨酸酯酶和酰氨酶活性的丝氨酸蛋白酶，可在凝血过程中发挥重要作用，主要用于出血性疾病的治疗。目前国内获批上市的蛇毒血凝酶类药物主要有注射用白眉蛇毒血凝酶（邦亭）、注射用矛头蝮蛇血凝酶（巴曲亭）、注射用尖吻蝮蛇血凝酶“苏灵”、兆科药业(合肥)有限公司的蛇毒血凝酶注射液（速乐涓）。现行蛇毒血凝酶类药物的质量标准主要利用生化反应、化学显色反应、液相色谱-肽图对照法或凝胶电泳法等进行鉴别，但这些方法均未对该类生化药物的种属来源进行鉴别，对于未知样品无法确实其种属来源。由于不同蛇种来源的血凝酶其结构不同，发挥作用机制不同，对应的药理作用也存在差异，因此有必要建立一种具有种属特异性的血凝酶类药物的鉴别检测方法，加强该类产品的质量控制，保障临床用药的安全性。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用，本专利技术提供的特征多肽种属鉴别方法简便快捷，专属性强，填补了注射用蛇毒血凝酶质量标准的空白，大大提高了该类药物质量控制水平，有利于保证临床用药的安全性和有效性。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽，所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽的氨基酸序列为：LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR。一种上述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用。优选地，所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用方法，包括以下步骤：A：注射用蛇毒血凝酶及白眉蛇毒类凝血酶特征多肽对照品分别溶解制成供试品及对照品溶液；B：分别取供试品溶液和对照品溶液，经二硫苏糖醇及碘乙酰胺还原烷基化处理；C：还原烷基化结束后，经碳酸氢铵溶液稀释后，加入酶进行水解；D：酶解结束后，高速离心，取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析；E：在检测离子对的提取离子流色谱图中，若供试品溶液呈现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品含有氨基酸序列LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR，证明待测样品来源于白眉蝮蛇；反之，则为非白眉蝮蛇来源。优选地，步骤E所述的检测离子对为三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3。优选地，上述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用方法，具体采用以下步骤：（1）取白眉蛇毒血凝酶特征多肽“LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR”10mg，置10mL量瓶中，用水溶解并定容，混匀，配置浓度为1mg/ml的对照品储备液1；取10μL对照品储备液1，用水溶解并定容至10ml，配置浓度为1μg/ml对照品储备液2；取600μL对照品储备液2，用25mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至10mL，制成60ng/mL的对照品溶液；取待测样品50mg，加25mmol/L碳酸氢铵溶液500μL溶解，即得供试品溶液；（2）量取供试品溶液、对照品溶液各400μL，加入0.4mol/L二硫苏糖醇溶液20μL，混匀，60℃反应1h，加入0.4mol/L碘乙酰胺溶液40μL，避光放置30min，加入0.4μg/μL胰蛋白酶10μL，37℃酶解1小时；90℃灭活10min，取出放冷至室温，1200rpm离心10min，取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析；（3）在检测离子对的提取离子流色谱图中，若供试品溶液呈现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品含有氨基酸序列LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR，证明待测样品来源于白眉蝮蛇；反之，则为非白眉蝮蛇来源；优选地，所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：色谱质谱条件：色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱50mm×2.1mm，1.7μm；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；柱温：40℃；进样量：2μL；流速：0.2mL/min，洗脱程序：0→1min，流动相A80%；1→5min，流动相A80%→10%；5→7min，流动相A10%→10%；质谱条件采用电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压5.5kV；碰撞室出口电压10V；入口电压10V；以三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3作为检测离子对，碰撞电压分别为45V和40V，去簇电压135V。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术利用NCBI和UniProt对已有蛇种蛋白库和毒液蛋白库进行整合后搜库比对，结合大量实验研究，寻找到了白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的特征多肽LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR，由于已知其它蛇种如矛头蝮蛇、蝰蛇和尖吻蝮蛇等蛇毒类凝血酶的氨基酸序列中均不含该段氨基酸序列，因此该特征多肽可用于专属性表征白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶。（2）传统类凝血酶鉴定方法无法对种属进行鉴定，经本专利技术提供的特征多肽种属鉴别方法简便快捷，专属性强，填补了注射用白眉蛇毒血凝酶质量标准的空白，大大提高了该类药物质量控制水平，有利于保证临床用药的安全性和有效性。附图说明图1为白眉蝮蛇类凝血酶特征多肽的二级质谱图及碎片归属；图2为白眉蝮蛇类凝血酶特征多肽的一级质谱图；图3为空白溶液的提取离子色谱图；图4为对照品溶液特征肽提取离子色谱图；图5为注射用白眉蛇毒血凝酶特征肽提取离子色谱图；图6为注射用矛头蝮蛇血凝酶特征肽提取离子色谱图。具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：下述实施例中相关试剂试药及溶液的制备方法如下：（1）试剂：胰蛋白酶（Sigma，批号SLBS8956），白眉蝮蛇蛇毒类血凝（锦州奥鸿药业，纯度为98.5%），盐酸胍（VETEC，批号WXBC4261V），三羟基氨基甲烷（沪市，批号20181206），二硫苏糖醇（BBILifeSciences，批号D911BA0011），碘乙酰胺（BBILifeSciences，批号B326BA1943），其它试剂均为分析纯。（2）25mmol/L碳酸氢铵溶液：称取79.06mg碳酸氢铵，加40mL水溶解，即得。（3）0.4mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液：称取15.42mg二硫苏糖醇，加250μL水溶解，即得。（4）0.4mol/L碘乙酰胺溶液（临用新制）：称取18.5mg碘乙酰胺，加250μL水溶解，即得。（5）0.4mg/mL胰蛋白酶溶液（临用新制）：称取胰蛋白酶8.0mg，加20mL水溶解，即得。实施例1特征多肽的筛选和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽，其特征在于，所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽的氨基酸序列为：LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR。/n

【技术特征摘要】
1.一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽，其特征在于，所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽的氨基酸序列为：LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR。


2.一种权利要求1所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用方法包括以下步骤：
A：注射用蛇毒血凝酶及白眉蛇毒类凝血酶特征多肽对照品分别溶解制成供试品及对照品溶液；
B：分别取供试品溶液和对照品溶液，经二硫苏糖醇及碘乙酰胺还原烷基化处理；
C：还原烷基化结束后，经碳酸氢铵溶液稀释后，加入酶进行水解；
D：酶解结束后，高速离心，取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析；
E：在检测离子对的提取离子流色谱图中，若供试品溶液呈现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品含有氨基酸序列LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR，证明待测样品来源于白眉蝮蛇；反之，则为非白眉蝮蛇来源。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤E所述的检测离子对为三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3。


5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤D中所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
色谱质谱条件：色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱50mm×2.1mm，1.7μm；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；柱温：40℃；进样量：2μL；流速：0.2mL/min，洗脱程序：0→1min，流动相A80%；1→5min，流动相A80%→1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王聪聪，石峰，咸瑞卿，巩丽萍，杭宝建，迟连利，张群业，杜宏明，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，山东大学，锦州奥鸿药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：山东;37