腈水解酶BnNIT2的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体涉及腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法。本发明专利技术确定Brassica napu来源的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白为腈水解酶，其最适pH为7.0，最适温度为45℃。50℃处理10 min约剩余50%酶活力，50℃处理1 h约剩余10%酶活力，在pH 6‑8范围内37℃处理1 h，剩余80%酶活力，适合于在食品、饲料、医药等行业中应用，消除菜籽粕中的抗营养物质。

【技术实现步骤摘要】
腈水解酶BnNIT2的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法
本专利技术涉及农业生物
，具体涉及腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法。
技术介绍
我国有丰富的杂粕蛋白质资源如：棉粕，菜籽粕，棕榈粕，花生粕等。在目前市场上优质蛋白质饲料资源严重短缺的情况下，杂粕蛋白质资源拥有良好的应用前景。但杂粕中抗营养物质的存在严重影响杂粕在饲料中的添加。如棉酚、凝结素等多酚类化合物能降低饲料中蛋白消化率；植酸、硫代葡糖苷等影响动物对微量元素的吸收等。现阶段消除抗营养物质的方法有物理法、化学法及生物法，其中饲料酶制剂的应用是消除抗营养物质有效的方式。菜籽粕是杂粕资源中的一大类别，消除菜籽粕中的抗营养物质对其在饲料中的应用具有重大推动作用。菜籽粕中一类抗营养物质为硫代葡糖苷，简称硫苷，是广泛存在于十字花科及相关物种含硫次生代谢物，目前已从数百种植物中发现120多种硫苷。硫苷能引起饲用动物甲状腺肿大，从而造成其生长发育迟缓，使菜籽粕难以作为优质饲料蛋白资源加以充分应用。硫代葡糖苷本身无毒，其降解产物如腈类化合物对动物生长发育有害。菜籽粕中的腈种类有很多，主要有：3-羟基-4-戊烯腈、4-戊烯腈、3-丁烯腈、3-吲哚乙腈等。腈水解酶（Nitrilase；EC3.5.5.1）是腈水解酶超级家族中的一种重要催化剂，它作为一种重要的工业酶不仅能将腈类化合物转化为高附加值的工业、食品和医药等产品的中间体，还能够直接将有毒腈化物转化为相应的无毒酸和氨，处理环境中的腈类污染物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供Brassicanapu来源的酶作为腈水解酶的应用。本专利技术的再一目的是提供一种消除饲料中腈化物毒性的方法。Brassicanapu来源的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的蛋白为腈水解酶。其中，该酶全长343个氨基酸，理论分子量为37kDa。腈水解酶BnNIT2的最适pH为7.0，最适温度为45℃。50℃处理10min约剩余50%酶活力，50℃处理1h约剩余10%酶活力。在pH6-8范围内37℃处理1h，剩余80%酶活力。上述腈水解酶基因的DNA全序列分析结果表明，腈水解酶BnNIT2结构基因全长为1029bp，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQIDNO：1氨基酸序列的该腈水解酶的核苷酸序列，如SEQIDNO：2所示。根据本专利技术的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述方法包括使用氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的酶水解饲料中腈化物的步骤。根据本专利技术的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述酶在30-50℃、pH6.0-pH8.0的条件下水解饲料中腈化物。根据本专利技术的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述酶在45℃、pH7.0的条件下水解饲料中腈化物。根据本专利技术的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述饲料为菜籽粕。本专利技术提供了上述腈水解酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产腈水解酶。该腈水解酶有效地催化菜籽粕中3-羟基-4-戊烯腈、4-戊烯腈、3-丁烯腈、3-吲哚乙腈等，从而可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的腈水解酶。附图说明图1显示腈水解酶BnNIT2的最适pH值；图2显示腈水解酶BnNIT2的pH稳定性；图3显示腈水解酶BnNIT2的最适反应温度；图4显示腈水解酶BnNIT2的热稳定性。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：pET28a载体，大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶，FastPfuDNA聚合酶，DNA回收试剂盒，质粒小提中量试剂盒。3、培养基：（1）LB液体培养基：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl。（2）LB固体培养基：在固体培养基的基础上加15g/L琼脂粉。（3）卡纳霉素：100mg/mL，0.22μM滤膜滤灭。（4）50×TAE：57.1mL/L冰醋酸，242g/LTris碱，50MEDTA，调至pH8.0（5）A液：2.5g氢氧化钠、18.7g磷酸氢二钠和15.9g磷酸钠,含250mg有效氯的次氯酸钠溶液，pH为11.7,ddH2O定容至500mL，得氢氧化钠与次氯酸钠复配液。B液：5.0g苯酚和0.025g亚硝基铁氰化钠,ddH2O定容至500mL,制得苯酚与亚硝基铁氰化钠复配液。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J．萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1BnNIT2基因的合成及表达载体构建利用NCBI数据库数据检索得到Brassicanapu来源的酶(NCBIReferenceSequence:XP_013699468.1)，命名BnNIT2。根据其氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，并根据表达载体pET28a的特点设计了酶切位点NcoI和XhoI。表1本实验所需的引物引物名称引物序列(5'---3')引物长度(bp)BnNIT2FAAGGAGATATACCATGAGCACGCTCA26BnNIT2RATGGTGGTGGTGCTCGAGTTTTTCCTTGGCCT31以合成的BnNIT2基因为模板，设计合成了带有NcoI和XhoI限制性酶切位点的引物F和R（见表1），对BnNIT2基因进行扩增。并利用NcoI和XhoI酶切PCR产物，连接进入表达载体pET28a(Invitrogen,SanDiego)，腈水解酶BnNIT2的序列插入到上述表达载体的下游，形成正确的阅读框架，构建成大肠杆菌表达载体pET28a-BnNIT2，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。表达质粒载体DNA，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），37°C培养1天，挑取在LB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。实施例2重组腈水解酶的制备（1）将重组菌株挑取单菌落于20mL的LB液体培养基中（含卡那霉素50mg/mL）,37℃，220rpm过夜培养。（2）将种子液按1：100转接于500mLLB液体培养基中（含卡那霉素50mg/mL）,37℃，220rpm培养。（3）OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1.0mM的IPTG。16℃，180rpm培养约20个小时。（4）取诱导后的菌液，4℃，4000rpm离心8min,收集菌体。（5）将收集的细胞用20mLA液悬浮，加入200μL蛋白酶抑制剂，混匀。（6）用超声波破碎仪对细胞进行破碎。破碎细胞频率为每间隔4s破本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白作为腈水解酶的应用。/n

【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的蛋白作为腈水解酶的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白在30-50℃的温度下发挥腈水解酶的活性。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白在45℃的温度下发挥腈水解酶的活性。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白在pH6.0-pH8.0下发挥腈水解酶的活性。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白在pH7.0下发挥腈水解酶的活性。

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【专利技术属性】
技术研发人员：罗会颖，张亨，姚斌，王亚茹，柏映国，黄火清，苏小运，王苑，涂涛，张杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11