一种凝血酶的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％，和/或将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，再在100±3℃的温度下进行水喷淋式干热处理。该制备方法不仅进一步降低了凝血酶产品中的杂质含量，并且显著地提高了凝血酶产品的效价和有效地去除了病毒，非常适合凝血酶产品的大规模工业生产。

A preparation method of thrombin

【技术实现步骤摘要】
一种凝血酶的制备方法
本专利技术属于生化制药领域，涉及一种凝血酶的制备方法，具体涉及一种能够提高效价、去除病毒和减少杂质，并且适合大规模工业生产的凝血酶的制备方法。
技术介绍
凝血酶是一种广泛存在于人体和动物血液中的丝氨酸蛋白酶，它是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显示出促凝和抗凝特性。当循环的凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血块稳定，从而在血栓性疾病的引发和发展中发挥核心作用。由于凝血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原，促使其转变为纤维蛋白、加速血液的凝固而止血，因此临床上将其用于外伤、手术、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、妇产科、消化道出血的止血，特别是用于手术中不易结扎的小血管止血、消化道出血及外伤出血的止血等。目前，临床上应用的凝血酶主要是由人血以及猪、牛等动物血分离提取的经凝血酶原激活物激活而得到的凝血酶的无菌冻干品，具有较高的专一性，是一种速效局部止血药，广泛应用于消化道出血和外科手术止血(宋宏新、马永征、李敏康，凝血酶分离纯化方法的研究进展，食品研究与开发，2004，25(6)：65-67)。其中，由于猪血来源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶产品都是由猪血制备的，少量的是由人血及牛血等血液制备的。猪凝血酶分子量约为35～39kDa，由两条多肽链通过一个二硫键连接而成，一条链分子量约为34kDa，另一条链分子量约为5kDa，等电点(pI)为5.0～5.5，IEF电泳显示二条带，pI分别为5.0和5.4(徐长法、王玉仙、刘德富等，猪凝血酶的分离纯化与鉴定，北京联合大学学报，1994，8(1)：44-49)。猪凝血酶的分离纯化过程大致包括猪血浆的预处理、凝血酶原的提取、凝血酶原的激活及粗凝血酶的制备、凝血酶的纯化等步骤。由于凝血酶制品是从猪血提取制备而得的多组分生化药品，具有潜在的猪源性病毒污染的隐患，为提高该制品安全性，有必要开展凝血酶病毒灭活工艺研究。进一步地，不论是从动物血还是从人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在以下几个问题：(1)凝血酶产品效价不稳定；(2)产品杂质及杂蛋白浓度偏高；(3)存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患。中国专利技术专利申请CN103160486公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括以下步骤：一、分离猪血浆；二、化学法病毒灭活；三、吸附凝血酶原；四、收集凝血酶原；五、纳米过滤；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的冻干保存。该专利申请并未公开用于病毒灭活的试剂和纳米膜的种类，而且所述方法得到的产品杂质含量偏高，其产品的效价也有待于进一步提高。综上，当前对产品效价更高、生产成本更低、更安全可靠的凝血酶产品及其制备方法还存在着迫切的需求。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种新的凝血酶的制备方法，该方法使用S/D法(即采用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液)联合干热法进行病毒灭活，同时采用N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺作为酶激活剂，其不仅进一步降低了凝血酶产品中的杂质含量，并且显著地提高了凝血酶产品的效价和有效地去除了病毒，非常适合凝血酶产品的大规模工业生产。一方面，本专利技术提供了一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％。另一方面，本专利技术提供了另一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。再一方面，本专利技术提供了另一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：(1)将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；(2)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。在上述的凝血酶的制备方法中，所述水喷淋式干热处理可以为将包含凝血酶的冻干产物置于水喷淋净化箱中，温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下，持续以热水喷淋包含凝血酶的冻干产物30至60分钟。优选地，在上述的凝血酶的制备方法中，所述包含凝血酶的提取液经过体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液的病毒灭活和去除处理。优选地，在上述的凝血酶的制备方法中，所述包含凝血酶的提取液经过酶激活剂激活处理；优选地，所述酶激活剂为N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺聚乙二醇-胺。优选地，本专利技术提供的凝血酶的制备方法包括以下步骤：(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂；(2)用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并进行透析；(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，得到包含猪凝血酶的提取液；(5)将包含猪凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；(6)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下进行水喷淋式干热处理30分钟至60分钟。更优选地，本专利技术提供的凝血酶的制备方法包括以下步骤：(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂，搅拌并静置以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂，并抽滤吸附剂吸附的猪血浆，弃去滤液；(2)用洗涤剂洗涤吸附剂，抽滤，弃去滤液，然后用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并使用透析液透析经过病毒灭活和去除处理的洗脱液；(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，使透析液中的N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺的浓度为0.5～1mol/L，控制温度为33～36℃，充分搅拌10～30分钟，降温至1～7℃，优选4℃，静本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：/n将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％。/n

【技术特征摘要】
1.一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％。


2.一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。


3.一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(2)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。


4.根据权利要求2或3所述的凝血酶的制备方法，其中所述水喷淋式干热处理为将包含凝血酶的冻干产物置于水喷淋净化箱中，温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下，持续以热水喷淋包含凝血酶的冻干产物30至60分钟。


5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的凝血酶的制备方法，其中所述包含凝血酶的提取液经过体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液的病毒灭活和去除处理。


6.根据权利要求1、3至5中任一项所述的凝血酶的制备方法，其中所述包含凝血酶的提取液经过酶激活剂激活处理；优选地，所述酶激活剂为N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂；
(2)用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；
(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并进行透析；
(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，得到包含猪凝血酶的提取液；
(5)将包含猪凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(6)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下进行水喷淋式干热处理30分钟至60分钟。


8.根据权利要求7所述的凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂，搅拌并静置以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂，并抽滤吸附剂吸附的猪血浆，弃去滤液；
(2)用洗涤剂洗涤吸附剂，抽滤，弃去滤液，然后用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；
(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并使用透析液透析经过病毒灭活和去除处理的洗脱液；
(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，使透析液中的N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺的浓度为0.5～1mol/L，控制温度为33～36℃，充分搅拌10～30分钟，降...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙丽，
申请(专利权)人：长春雷允上药业有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22