一种凝血酶的制备方法技术

本发明专利技术提供一种凝血酶的制备方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入凝血酶原激活剂以激活凝血酶原，得到包含凝血酶的溶液，所述凝血酶原激活剂选自重组脂化组织因子，或重组脂化组织因子和钙离子。所述方法还包括在激活凝血酶原之前，制备包含凝血酶原的溶液。所述方法还包括对包含凝血酶的溶液进行纯化和进一步处理，得到凝血酶成品。本发明专利技术的制备方法采用重组脂化组织因子为激活剂，与兔脑粉相比，可显著提供凝血酶产品的安全性，降低生产成本；与大豆磷脂和蛋黄磷脂相比较，明显提升凝血酶比活性，非常适合现代大规模工业生产。

【技术实现步骤摘要】
一种凝血酶的制备方法
本专利技术涉及生物制药领域，尤其涉及一种凝血酶的制备方法。
技术介绍
凝血酶是一种重要的细胞外丝氨酸蛋白酶，其由两条肽链组成，以二硫键相连，是机体凝血系统中的重要组成部分。凝血酶为凝血因子IIa，可直接作用于纤维蛋白原，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，从而使血液快速凝固，填塞出血点，达到止血的目的。凝血酶是由凝血酶原的激活产生的，即需要凝血酶原激活物(激活剂)的存在，才可以将血液中的凝血酶原激活，形成凝血酶。在外源性凝血过程中，血液中的凝血因子VII与凝血因子III结合，在钙离子的作用下，激活凝血因子X转变为凝血因子Xa；凝血因子Xa与凝血因子V、血小板3因子(PF3)及钙离子形成凝血酶原复合物，凝血酶原复合物作用于凝血酶原，产生凝血酶。目前常用的凝血酶原激活物(激活剂)主要为氯化钙、枸橼酸钠、大豆磷脂或蛋黄磷脂、组织因子(促凝血酶原激酶)等。组织因子(TF)是一种由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，分子量约为47kDa，其多来源于脑、胎盘或肺组织，常见的来源包括兔脑粉。CN201810585957.5公开了一种冻干人凝血酶的制备工艺，其在得到人凝血酶原后，加入氯化钙溶液，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂作为激活剂对人凝血酶原激活，得到人凝血酶粗溶液。但凝血酶的激活过程中使用大豆磷脂或蛋黄磷脂的激活效果较差。CN201510638083.1公开了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，其中向兔脑粉中加入生理盐水，再加入凝血酶原溶液和CaCl2进行酶原激活，得凝血酶粗酶液，超滤脱盐并浓缩，进行病毒灭活，所得粗酶液过层析柱，洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶。与大豆磷脂或蛋黄磷脂相比，兔脑粉的激活效果更好，但兔脑粉为外源性物质，容易引入病毒和过敏反应原，在生产过程中需要额外对兔脑粉进行病毒灭活，这增加了生产步骤且提高了生产成本。CN201811040796.8公开了一种猪凝血酶的制备方法，包括：1)血浆的制备、2)S/D法病毒灭活、3)凝血酶原粗品制备、4)凝血酶激活液制备、5)凝血酶纯化、6)超滤脱盐和7)纳米膜除病毒。该方法也需要额外的除病毒步骤，同样增加了生产步骤且提高了生产成本。因此，急需解决的问题是寻找一种操作简便且成本低廉的制备凝血酶的新方法。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术中存在的不足之处，提供了一种新的凝血酶的制备方法。该方法采用重组脂化组织因子为激活剂，与兔脑粉相比，可显著提升凝血酶产品的安全性，降低生产成本；与大豆磷脂和蛋黄磷脂相比，可明显提高凝血酶产品的比活，非常适合现代大规模工业生产。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一方面，本专利技术提供了一种凝血酶的制备方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入凝血酶原激活剂以激活凝血酶原，得到包含凝血酶的溶液，其中所述凝血酶激活剂为重组脂化组织因子。在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子在溶液中的终浓度为0.05mg/L至2.5mg/L，优选为0.1mg/L至0.5mg/L。优选地，上述凝血酶的制备方法包括向包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子和钙离子以激活凝血酶原。其中，所述钙离子可以以氯化钙或碳酸钙的形式加入。优选地，所述钙离子在溶液中的终浓度为0.05mol/L至0.14mol/L，优选为0.05mol/L至0.1mol/L，最优选为0.07mol/L。优选地，所述钙离子在加入重组脂化组织因子激活凝血酶原之后加入。在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子与钙离子在溶液中的终浓度之比为1:0.03至1:1.4(mg:mol)，优选为1:0.14至1:1(mg:mol)，最优选为1:0.14至1:0.7(mg:mol)。在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子激活凝血酶原的时间为2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min；所述钙离子激活凝血酶原的时间为10-22min，优选为12-20min，最优选为15-18min。在上述制备方法中，所述激活凝血酶原的温度为32～38℃，优选为33～35℃，最优选为35℃。在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子选自重组动物脂化组织因子和/或重组人脂化组织因子；优选地，所述重组脂化动物组织因子为重组脂化兔组织因子。其中，重组脂化人组织因子是由重组人组织因子脂化制备得到的。重组人组织因子是通过人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组获得的，分子量为27.4kDa，具有生物活性，其脂化后具有更强的凝血活性。根据本专利技术的凝血酶的制备方法，所述包含凝血酶原的溶液的制备方法包括以下步骤：在新鲜血液中加入抗凝剂，离心，过滤，得到血浆；在血浆中加入吸附剂，先用0.2M氯化钠水溶液和3g/L的柠檬酸三钠水溶液分别进行洗涤，再用2M氯化钠水溶液和3g/L的柠檬酸三钠水溶液分别进行洗脱，保留洗脱液，最后用分子量7000的透析袋对洗脱液进行透析，得到包含凝血酶原的溶液；其中，所述新鲜血液可以选自人或动物的新鲜血液，优选为新鲜猪血；所述抗凝剂可以为柠檬酸三钠溶液或EDTA溶液，优选为20-40g/L的柠檬酸三钠溶液；所述吸附剂可以是阴离子交换树脂，优选为DEAE-sephadex-A50离子交换树脂。根据本专利技术的一个实施方案，所述凝血酶的制备方法包括向32～38℃，优选为33～35℃的包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子，搅拌2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min，然后置于0～15℃下0.5-2.0小时。根据本专利技术的一个优选实施方案，所述凝血酶的制备方法包括向32～38℃，优选为33～35℃的包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子，搅拌2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min，之后加入钙离子，混合后在32～38℃，优选为33～35℃下搅拌10-22min，优选为12-20min，最优选为15-18min，然后置于0～15℃下0.5-2.0小时。优选地，本专利技术所述的凝血酶的制备方法还包括对所述包含凝血酶的溶液进行纯化。进一步优选地，所述纯化包括用酸将所述包含凝血酶的溶液调节至pH5.0-6.0，优选为pH5.4，第一次离心后收集上清液；然后用碱将上清液调节至pH6.0-7.0，第二次离心后收集上清液。进一步优选地，所述酸为盐酸、草酸或醋酸中的一种或多种，优选为醋酸。进一步优选地，所述碱为碳酸钠、氨水或碳酸氢钠中的一种或多种，优选为碳酸氢钠。优选地，本专利技术所述凝血酶的制备方法还包括对纯化的包含凝血酶的溶液进行病毒灭活和冻干，得到凝血酶成品。根据本专利技术的一个具体实施方案，所述凝血酶的制备方法包括：1.在新鲜血液中加入抗凝剂，离心，过滤，得到血浆；在血浆中加入吸附剂，先用0.2M氯化钠水溶液和3g/L柠檬酸三钠水溶液分别进行洗涤，再用2M氯化钠水溶液和3g/L柠檬酸三钠水溶液分别进行洗脱，最后用分子量为7000的透析袋对洗脱液进行透析，得到包含凝血酶原的溶液；2.将包含凝血酶原的溶液在水浴中加热至32～38℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝血酶的制备方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入凝血酶原激活剂以激活凝血酶原，得到包含凝血酶的溶液，其中所述凝血酶原激活剂为重组脂化组织因子。/n

【技术特征摘要】
1.一种凝血酶的制备方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入凝血酶原激活剂以激活凝血酶原，得到包含凝血酶的溶液，其中所述凝血酶原激活剂为重组脂化组织因子。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子在溶液中的终浓度为0.05mg/L至2.5mg/L，优选为0.1mg/L至0.5mg/L。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子和钙离子以激活凝血酶原；
优选地，所述钙离子以氯化钙或碳酸钙的形式加入；
优选地，所述钙离子在溶液中的终浓度为0.05mol/L至0.14mol/L，优选为0.05mol/L至0.1mol/L，最优选为0.07mol/L；
优选地，所述钙离子在加入重组脂化组织因子激活凝血酶原之后加入。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子与钙离子在溶液中的终浓度之比为1:0.03至1:1.4(mg:mol)，优选为1:0.14至1:1(mg:mol)，最优选为1:0.14至1:0.7(mg:mol)。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子激活凝血酶原的时间为2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min；所述钙离子激活凝血酶原的时间为10-22min，优选为12-20min，最优选为15-18min。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述激活凝血酶原的温度为32～38℃，优选为33～35℃，最优选为35℃。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子选自重组动物脂化组织因子和/或重组人脂化组织因子；优选地，所述重组脂化动物组织因...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱振涛，孙丽，曹思瑶，张娜，辛欣，咸思焕，胡锡旺，
申请(专利权)人：长春雷允上药业有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22