一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用。在经过蚀刻处理的毛细管柱中采用水（溶剂）热法制备涂覆纳米二氧化钛的开管毛细管电泳柱，具有制备方法简单，涂覆层不易脱落等特点，适宜于复杂生物样品中功能化磷酸化多肽与蛋白质的选择性富集与分离。二氧化钛分子与毛细管内壁表面硅羟基通过化学键结合，纳米二氧化钛微粒颗粒均匀，涂覆完全，能有效减少对蛋白质等大分子样品的非特异性吸附作用。涂覆层表面性质和微孔结构可通过改变水热混合物的中致孔剂的种类和比例方便的进行控制，得到孔径、比表面积可调的磷酸化多肽毛细管柱。

【技术实现步骤摘要】
一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用
本专利技术涉及开管电泳柱
，具体地说，是一种涂敷纳米二氧化钛 的开管电泳柱的制备方法及其应用。
技术介绍
蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用，因此也是目前 翻译后修饰蛋白质组研究中的热点。但大规模分析磷酸化蛋白质在技术上还 很具有挑战性，主要的技术挑战是分析灵敏度。由于生物体内磷酸化蛋白质的含量少、化学计量值低，因此细胞内多数 蛋白质中仅有少部分被磷酸化， 一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量10% ，所以即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平，该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难。目前采用的分析方法远远不能达到对复杂 组织中的磷酸化蛋白质规模化检测及位点分析的要求，所以磷酸化蛋白质谱 的分析不同于一般蛋白质表达谱的分析方法，需要建立更有效的分离手段、 更特异的富集方法和更灵敏的检测技术。目前已经发展了各种各样的富集方 法和色谱填料，如抗体亲和色谱、固定化金属亲和色谱、强阳离子交换色谱 等方法以及石墨碳、二氧化钛、二氧化锆等填料。二氧化钛是近年来发展起来的一种新型高性能材料，其表面能和表面张 力随粒径的下降急剧增大而使其具有特殊的量子尺寸效应、体积效应、表面 效应和宏观隧道效应。与常规材料相比，纳米二氧化钛具有比表面积大、表 面活性大、热导性好，分散性好等独特性能。此外，纳米二氧化钛还具有水油两亲和性，属"超双亲性界面材料"，二氧化钛与磷酸根之间存在路易斯酸 碱作用，能够选择性地富集蛋白质酶解产物中的磷酸化多肽。毛细管电色谱 开管柱主要通过涂布、键合和溶胶凝胶等方法在柱内壁制备薄层固定相。开 管柱避免了繁琐的颗粒填充过程，也免去了制备塞子所以制备过程简单，并 且毛细管电色谱开管柱在生物样品的分离、手性体的拆分等方面获得了应用。 毛细管二氧化钛开管柱能够选择性地富集和分析蛋白质酶解产物中的磷酸化 多肽，与电喷雾质谱联用，可高通量、自动化分析蛋白质酶解产物中的磷酸 化多肽的信息。通常采用的溶胶-凝胶法、化学沉淀法气相法制备纳米二氧化钛的方法都 需要后期锻烧，除了极易导致粉体团聚，从而使其的性能指标大受影响以外， 也不适于应用于毛细管开管柱的制备。水(溶剂)热法是制备纳米二氧化钛 的新方法，具有结晶好、团聚少、纯度高、粒度分布窄以及形貌可控等特点。 它反应温度较低，能够合成出绝大多数的氧化物。在溶液中加入某种能缓慢 生成沉淀剂的物质，使溶液中的沉淀均匀出现，称为均匀沉淀法。均匀沉淀 法既改进了直接沉淀法制备粉体中存在的反应物混合不均匀，反应速率不可 控制等缺点，又克服了溶胶一凝胶法使用的金属醇盐成本高的缺点。它还具 有工艺简单、操作简便、对设备要求不高、产物纯度高、粒度和组成均匀等 优点在超细(纳米)粉末的各种制备方法中，水热法被认为是环境污染少、成本 较低、易于商业化的一种具有较强竞争力的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种涂敷纳米二氧化钛的 开管电泳柱的制备方法及其应用。本专利技术的构思为 一种可对磷酸化多肽和蛋白质选择性富集与分离的内壁涂覆纳米二氧化钛的毛细管电泳开管柱制备方法；毛细管内壁均匀化学键和纳米级二氧化钛微粒，.具有特殊的表面量子尺寸效应、体积效应、表面效应和宏观隧道效应及高表面活性；为获得均匀键和的高比表面积毛细管开管 柱， 一般用HF对毛细管内壁进行蚀刻，并用NaOH对表面的硅羟基进行活化， 以增强硅羟基与二氧化钛的结合能力。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的 一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，包含步骤为，(一) 毛细管柱的预处理将毛细管柱依次用稀酸、稀碱冲洗10 60分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后备用；所述的毛细管柱为石英基质，内径为1微米 1毫米； 所述的稀酸选自盐酸，硫酸或者硝酸中的一种，其中，盐酸浓度为O.lmol/L;硫酸浓度为0.1mol/L;硝酸浓度为0.1mol/L;优选为盐酸；所述的稀碱选自氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液中的一种，氢氧化钠溶 液浓度为lmol/L;氢氧化钾溶液浓度为lmol/L;取50拜的毛细管柱将其充满浓度为35% 45%的氢氟酸溶液，浓度优选 为40%，在室温下蚀刻120 160分钟后，时间优选为140分钟，用水清洗， 将蚀刻成功的接口用lmol/L氢氧化钠溶液浸泡过夜，以中和掉残余的氢氟酸，用水洗净后N2吹干备用；(二) 开管柱的制备(1) lml无水乙醇加入钛酸四丁酯至lmol/L搅拌均匀；(2) 加入聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙垸或者聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物至0.05mol/L;(3) 通N2除去溶解的氧气；(4) 加入HCl溶液调pH1 2，搅拌均匀；(5) 将以上溶液充入毛细管柱中，并将毛细管柱两端封口；(6) 再放入反应釜中加热至11(TC 15(TC，优选为13(TC，反应时间11 13小时，优选为12小时；(7) 自然冷却后，用水、乙醇分别冲洗三次，除去致孔剂；所述的致孔剂是聚环氧乙烷-聚环氧丙垸-聚环氧乙烷或者聚氧乙烯-聚氧 丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物和乙醇；(8) 最后用N2吹干；与一般的开管柱相比，纳米二氧化钛涂层具有纳米材料特有的量子尺寸 效应、体积效应、表面效应。二氧化钛与磷酸化多肽与蛋白的磷酸根以路易 斯酸碱的形式结合进行选择性富集与分离。具有稳定的优点，与管壁化学键 合强度好，不易发生脱落，因而使用寿命较长。色谱柱稳定性和重复性较好， 并能有效的实现对复杂生物样品体系中磷酸化多肽与蛋白的选择性分离与富 集。通过改变致孔剂与钛酸四丁酯的配比得到不同表面性质的电泳柱，制备 方法简单易行，重复性与稳定性极佳。与现有的二氧化钛开管毛细管柱相比，本专利技术制备的二氧化钛开管毛细 管柱采用水(溶剂)热法，在经过蚀刻处理的毛细管柱中制备了涂覆纳米二 氧化钛的开管毛细管电泳柱，用于复杂生物样品中功能化磷酸化多肽与蛋白 质的选择性富集与分离。其制备方法简单，二氧化钛分子与毛细管内壁表面 硅羟基通过化学键结合，涂覆层不易脱落。纳米二氧^:钛微粒颗粒均匀，涂 覆完全，有效减少对蛋白质等大分子样品的非特异性吸附作用。涂覆层表面性质和微孔结构可通过改变水热混合物的中致孔剂的种类和比例方便的进行 控制，得到孔径、比表面积可调的磷酸化多肽毛细管柱。本专利技术一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应用的积极 效果是(1) 采用水热法制备纳米二氧化钛涂层，制备方法简单，无需高温煅烧;(2) 可通过改变致孔剂和钛酸四丁酯比例控制纳米二氧化钛涂层表面性 质，充分利用纳米材料特殊的量子尺寸效应、体积效应、表面效应；(3) 由于是用化学键与毛细管壁表面硅羟基结合，所以柱子稳定性较好， 不会出现涂层脱落的现象；(4) 重复性好，水热法制备的纳米涂层稳定性好，重复使用多次数据较重复。附图说明图1 Si02-Ti02交叉表面扫描电镜图2 二氧化钛开管柱富集P-酪蛋白酶解产物色谱图3 a -酪蛋白(5 picomoles)酶解产物经二氧化钛开管柱富集后质谱图。具体实施方式以下提供本专利技术一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应 用的具体实施方式。实施例1开管电泳柱的制备将lml无水乙醇，钛酸四丁酯0.34g，聚环氧乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法，其特征在于，包含步骤为，　（一）毛细管柱的预处理　将毛细管柱依次用稀酸、稀碱冲洗１０～６０分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后备用；　所述的稀酸选自盐酸，硫酸或者硝酸中的一种；所述的稀碱选自氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液中的一种；　取５０μｍ的毛细管柱将其充满浓度３５％～４５％的氢氟酸溶液，在室温下蚀刻１２０～１６０分钟后，用水清洗，将蚀刻成功的接口用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液浸泡过夜，以中和掉残余的氢氟酸，用水洗净后Ｎ↓［２］吹干备用；　（二）开管柱的制备　（１）１ｍｌ无水乙醇加入钛酸四丁酯至１ｍｏｌ／Ｌ搅拌均匀；　（２）加入聚环氧乙烷－聚环氧丙烷－聚环氧乙烷或者聚氧乙烯－聚氧丙烯－聚氧乙烯嵌段共聚物至０．０５ｍｏｌ／Ｌ；　（３）通Ｎ↓［２］除去溶解的氧气；　（４）加入ＨＣｌ溶液调ｐＨ１～２，搅拌均匀；　（５）将以上溶液充入毛细管柱中，并将毛细管柱两端封口；　（６）再放入反应釜中加热至１１０℃～１５０℃，反应时间１１～１３小时；（７）自然冷却后，用水、乙醇分别冲洗三次，除去致孔剂；　所述的致孔剂是聚环氧乙烷－聚环氧丙烷－聚环氧乙烷或者聚氧乙烯－聚氧丙烯－聚氧乙烯嵌段共聚物和乙醇；　（８）最后用Ｎ↓［２］吹干。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李英杰，高立娣，苏立强，吕仁江，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：23[中国|黑龙江]