SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了SAMD9突变型蛋白，所述SAMD9突变型蛋白的氨基酸序列缺少第61~448位氨基酸。本发明专利技术还公开了编码该蛋白的基因、细胞系及其在制备山羊痘病毒疫苗中的应用。本发明专利技术还公开了SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系的制备方法。本发明专利技术通过基因编辑技术敲除了Vero细胞SAMD9基因的AlbA_2结构域及其两侧序列，以降低Vero细胞的病毒抑制功能，获得的SAMD9突变型蛋白Vero细胞对山羊痘病毒具有更高的易感性，且遗传性状稳定，能够应用到山羊痘病毒等病毒疫苗生产中，替代原代细胞疫苗生产工艺，大幅度降低生产成本，并提高疫苗的安全性。

【技术实现步骤摘要】
SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用
本专利技术属于生物制品领域，涉及细胞与病毒疫苗领域，具体涉及SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用。
技术介绍
非洲绿猴肾细胞(Vero)是世界卫生组织允许用于疫苗生产的细胞株，它的研究背景相对清晰，又对多种病毒敏感，在病毒的分离培养、机制研究等方面也具有非常重要的应用价值。在痘病毒研究方面，早从上世纪70年代起就陆续有报道猴痘病毒(Lourie，Binghametal.1972)、痘苗病毒(TsuchiyaandTagaya1979)、小鼠痘病毒(Tantawi，Zaghlouletal.1983)、骆驼痘病毒(elHarrak，Loutfietal.1991)等正痘病毒属病毒，羊口疮等副痘病毒属病毒(Rziha，Henkeletal.2000)均可在Vero细胞生长形成病变灶。但是，常用的Vero细胞在羊痘病毒属痘病毒(山羊痘病毒、绵羊痘病毒、皮肤结节病病毒)培养方面的应用却表现出很大的局限性。山羊痘病毒和绵羊痘病毒对原代羔羊睾丸细胞和肾细胞最易感(OIE陆生动物手册，2017)，直接在Vero细胞上接种往往不能出现稳定的病变。现有的山羊痘病毒和绵羊痘病毒Vero细胞适应株是先将羊痘病毒在原代羊细胞中连续传代几十代，再转接种至Vero细胞上连续传代9～26代以上而成的(Hosamani，Nandietal.2004)，(Chaudhary，Pandeyetal.2009)。即便如此，仍然有很多羊痘病毒株在Vero细胞上不能稳定产生病变(6代以后病变消失，安维雪等，2016)或者增殖效价相对较低(比原代羊睾丸细胞培养低31.6～63.1倍，李春艳，2011)，导致我国现有的羊痘疫苗生产工艺仍然摆脱不了原代羊睾丸细胞生产方法(中华人民共和国兽药典三部2015版)。然而，原代细胞制备需要大量新鲜羔羊组织，羔羊组织的无菌摘取操作要求复杂、组织中细胞数量有限、羔羊成本较高，严重限制了山羊痘疫苗的批生产产量。目前国内绵羊养殖水平不一，羔绵羊感染布氏杆菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒等致病菌及病毒的风险仍然较高，也在很大程度上增加了操作人员生物安全风险和生产检验成本。因此，如能显著提高Vero细胞增殖羊痘病毒的能力，替代现有原代细胞培养方法，必将有力提升羊痘疫苗生产技术，促进羊病防控领域的技术进步。随着功能基因组学的发展，蛋白质相互作用的研究已成为分子生物学家研究的热点之一，蛋白质与其他蛋白质之间形成的稳定或临时复合物，对生物体的活动如信号引导、转录、代谢网络调控等有很多影响。目前对羊痘病毒在宿主细胞中增殖的机制仍然较为缺乏，但是Vero细胞中有一种广泛存在于多种动植物细胞质中的蛋白——SAMD9蛋白，可能与应激、抗病毒和细胞凋亡有关。RNA干扰试验证明，SAMD9是细胞固有免疫的关键蛋白，其表达量下降能够明显提高细胞内日本乙型脑炎病毒(JEV)的复制(ZhangLK，2013)。痘苗病毒感染Vero细胞后，细胞中的SAMD9蛋白可以与痘苗病毒的C7L家族蛋白结合，形成“分子爪”状结构，抑制核糖体中cap依赖性蛋白质的合成和抑制病毒mRNA的解离，阻断病毒mRNA翻译过程(MengX，2015)。早期研究分析预测认为，SAMD9家族蛋白主要架构从N端至C端依次为：一个SAM结构域、一个AlbA_2结构域、一个SIR2家族组蛋白脱乙酰酶类似结构域、一组P环型三磷酸酶(P-loopNTPase)结构域串联TPR重复序列，和一个类似冷休克DNA结合蛋白的C端OB折叠结构域。其中SAM结构域和P-loopNTPase结构可能具有调节细胞凋亡和炎症信号通路的作用，AlbA_2结构域(在SIR2类似结构域的辅助下)和C端OB折叠结构域可能具有结合病毒核酸的能力，从而介导SAMD9蛋白对病毒复制的抑制作用(Mekhedov，Makarovaetal.2017)。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服细胞固有免疫对Vero细胞增殖山羊痘病毒的限制，通过基因编辑突变非洲绿猴肾细胞Vero细胞(源自ATCC细胞库，编号ATCCCCL-81)的SAMD9基因中核酸结合区AlbA_2结构域编码区域，降低SAMD9蛋白的抑制病毒功能，从而提高山羊痘病毒在Vero细胞上的增殖能力，为山羊痘疫苗生产提供优秀细胞系。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了SAMD9突变型蛋白，所述SAMD9突变型蛋白的氨基酸序列缺失第61～448位氨基酸(AlbA_2结构域及两侧共388aa的序列)。其中，所述的SAMD9突变型蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本
技术实现思路
还包括编码所述的突变型蛋白的SAMD9突变型基因。其中，所述SAMD9突变型基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本
技术实现思路
还包括SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系，其含有所述的基因。本
技术实现思路
还包括所述的SAMD9突变型蛋白的细胞系的制备方法，包括以下步骤：通过扩增测序获取了Vero细胞SAMD9基因序列，在其AlbA_2结构域两侧设计基因敲除sgRNA，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对Vero细胞SAMD9基因的AlbA_2结构域实施基因敲除，经过克隆筛选纯化获得SAMD9突变型Vero细胞，命名为VeroSAMD9。其中，所述gRNA序列如SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示。其中，所述克隆筛选中采用的PCR引物序列如SEQIDNO：7或SEQIDNO：8所示。本
技术实现思路
还包括所述的突变型蛋白、所述的突变型基因、所述的细胞系在制备山羊痘病毒疫苗中的应用。本
技术实现思路
还包括一种山羊痘病毒疫苗，所述疫苗包括所述的SAMD9突变型蛋白。与亲本Vero细胞相比，本专利技术的突变型细胞VeroSAMD9株缺失了181～1344bp区域共计1164bp碱基序列。推导其氨基酸序列，VeroSAMD9细胞的SAMD9基因编码1200aa蛋白，与亲本细胞相比，该细胞缺失了AlbA_2结构域及两侧共计388个氨基酸。VeroSAMD9株的SAMD9突变型基因编码序列为：SEQIDNO：1VeroSAMD9株的SAMD9突变型蛋白氨基酸序列为：SEQIDNO：2突变型克隆株VeroSAMD9的细胞形态较为单一，为均匀的上皮样细胞。绘制的细胞生长曲线表明，VeroSAMD9株在接种24小时即呈对数生长，形成细胞单层后可维持良好细胞形态168小时以上，为山羊痘病毒的充分增殖创造了良好的细胞条件。与亲本株相比，VeroSAMD9株的细胞饱和密度较为一致，但细胞倍增时间缩短，细胞贴壁更好，形成较大集落，其种板效率是亲本株的2.46倍左右。应用山羊痘病毒疫苗毒AV41株(购自中国兽医药品监察所菌种保藏管理中心)感染VeroSAMD9株发现，AV41株在VeroSAMD9上的效价可以达到107.25TCID50/ml，比亲本Vero株(104.125TCID50/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SAMD9突变型蛋白，其特征在于，所述SAMD9突变型蛋白的氨基酸序列缺失第61~448位氨基酸。/n

【技术特征摘要】
1.SAMD9突变型蛋白，其特征在于，所述SAMD9突变型蛋白的氨基酸序列缺失第61~448位氨基酸。


2.根据权利要求1所述的SAMD9突变型蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


3.编码权利要求1或2所述的突变型蛋白的SAMD9突变型基因。


4.根据权利要求3所述的SAMD9突变型基因，其特征在于，所述SAMD9突变型基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


5.SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系，其含有权利要求3或4所述的突变型基因。


6.根据权利要求5所述的SAMD9突变型蛋白的细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过扩增测序获取了Vero细胞SAMD9基因序列，在其AlbA_2结构域两侧设计基因敲除sgRNA，采用CRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐娜，沈志强，张倩，苑文娴，管宇，肖跃强，苗立中，
申请(专利权)人：山东绿都生物科技有限公司，山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37