一种铁冬青茎段组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种铁冬青茎段组织培养方法，1)取半木质化枝条消毒，切成茎段；2)将茎段接种到芽诱导培养基中培养得到出不定芽丛或单芽；3)将不定芽丛或单芽剪下，接种到芽增殖培养基中，得到无菌苗；4)剪取无菌苗，切口在已灭菌的ABT溶液中速蘸，接种至生根培养基上中培养，获得生根苗；5)生根瓶苗炼苗及移栽；所述芽增殖培养基：改良B1培养基、6‑BA 0.4～0.8mg/L、NAA 0.2～0.4mg/L、GA

A method of tissue culture of Ilex latifolia stem segment

【技术实现步骤摘要】
一种铁冬青茎段组织培养方法
本专利技术属于植物离体无性繁殖
，具体涉及一种铁冬青茎段组织培养方法。
技术介绍
铁冬青(Ilexrotunda)为冬青科(Ilex)冬青属(holly)常绿乔木或灌木，又名：救必应，龙胆仔、白沉香，高5～20米，胸径达1米；铁冬青树叶厚而密，能形成阴蔽的环境，花果由黄转红，又能产生多层次丰富景色的效果，十分可爱，是理想的园林观赏树种，采取老桩或抑制生长使其矮化，也是制作盆景的好树种。药用部位为树皮或根皮，中药名称救必应，具有清热解毒，利湿，止痛功效，可治感冒发热，扁桃体炎，咽喉肿痛，急慢性肝炎，急性肠胃炎，胃及十二指肠溃疡，风湿关节痛，跌打损伤，汤火伤，是多种中成药的原料，临床上常用于治疗心血管疾病及多种感染性疾患。枝叶作造纸糊原料，树皮可提制染料和栲胶，果实可提取果红色素；木材作细工用材。用火烧叶子，不燃烧会形成黑色圆圈，故可做防火树种。铁冬青为亚热带树种,喜湿润肥沃、排水良好的酸性土壤，适应性较强，耐阴，耐瘠，耐旱，耐霜冻，极具发展前景。铁冬青繁育的主要方式有播种育苗、扦插育苗和组织培养。刘济详等人报道，采种后种子用湿沙低温储藏一年，铁冬青种子育苗时间长，难以在短时间繁殖大量苗木。温美霞等人报道铁冬青扦插研究，铁冬青为较难生根树种,生根类型为皮部和愈伤组织混合生根，采用当年生半木质化插条,以黄心土为基质,进行低浓度长时间生根剂处理能有效提高铁冬青扦插生根率。通过组织培养获得再生植株，是有效解决铁冬青种苗繁殖的有效途径。国内研究铁冬青组织培养的报道较少，严荣斌等以3a生铁冬青茎段为外植体,探讨不同培养基对铁冬青芽诱导和增殖效果，结果表明：铁冬青采用MS+6-BA1ml/L+IAA0.2ml/L诱导,萌芽天数12天，萌芽条数2，增殖培养基采用1/2MS+6-BA1.5ml/L+IAA0.5ml/L，增殖系数为3.3。杨灿等用红果冬青新出枝条嫩芽为外植体，增殖系数为4.1，生根率达90％。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种铁冬青茎段组织培养方法，该方法可以大大提高继代增殖系数，且无菌苗健壮，生根率高，确保种苗优良性状。本专利技术提供的技术方案是一种铁冬青茎段组织培养方法，包括以下步骤：1)外植体获取：取半木质化枝条消毒，切成茎段，备用；2)芽诱导：将茎段接种到芽诱导培养基中培养得到出不定芽丛或单芽；所述芽诱导培养基包括以下组分：改良B1培养基、6-BA0.2～0.4mg/L、NAA0.1～0.2mg/L、GA30.1mg/L、蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；3)芽增殖：将不定芽丛或单芽剪下，接种到芽增殖培养基中，得到无菌苗；所述芽增殖培养基包括以下组分：改良B1培养基、6-BA0.4～0.8mg/L、NAA0.2～0.4mg/L、GA30.1mg/L、活性炭0.1～0.2g/L、蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；所述改良B1培养基以1L计，包含以下组分：步骤1)中半木质化枝条可以是铁冬青树上直接摘取的半木质化枝条；也可以是从树上摘取的硬枝条(完全木质化)，由于完全木质化硬枝条无法直接培养，需要进行扦插培养，从而获取半木质化枝条。半木质化枝条的获取方法为：将铁冬青完全木质化的硬枝条剪成插条，插条浸泡在600～800mg/L的ABT溶液0.5～1h，然后将其扦插到装有基质的营养袋中，扦插基质由黄心土、泥炭土和沙组成，其重量比为2：2：1。在温度15～25℃、相对湿度60％～80％下，先在光照强度500～2000Lux、每天光照12～14h下培养10～15d，待扦插枝条有新芽长出后，保湿温度湿度不变，提高光照强度至2000～6000Lux、每天光照12～14h，继续培养10～20d，即得半木质化枝条。步骤2)中，所述芽诱导培养条件为：先暗培养7～10d至腋芽萌出，然后置于100～500Lux、每日光照10～12h下培养7d，再置于500～5000Lux、每日光照10～12h下继续培养10～15d。步骤3)中，所述芽增殖培养条件为：先置于光照强度500～1000Lux、每日光照10～12h下培养5～7d后，再置1000～5000Lux、每日光照10～12h下继续培养10～15d。还包括生根培养步骤，所述生根培养是将无菌苗在20～50mg/L的ABT溶液中速蘸1～5s，然后接种到生根培养基上培养，得到生根苗；所述生根培养基包括以下组分：1/2改良B1培养基、ABT0.6～0.9mg/L、NAA0.2～0.3mg/L、活性炭0.1～0.2g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉4.5g/L、pH5.8。所述生根培养条件为：先置于光照强度100～500Lux、每日光照10～12h下培养5～7d，待无菌苗的切口开始长根后，再置于2000～5000Lux、每日光照10～12h下培养5～8d。还包括炼苗，将生根苗移至炼苗棚中，在温度15～30℃，光照强度5000～10000Lux，每天光照12～14h，炼苗时间为5～7d。还包括移栽，将炼苗后的生根苗从炼苗棚中移出，用清水洗去小苗根系的培养基，然后将苗移栽至装有基质的育苗袋内，移栽基质由黄心土、泥炭土和沙组成，其重量比3：5：2；移栽在育苗棚内进行，移栽后要浇透水，用薄膜覆盖保温保湿，10d后逐步通风，20d后移除薄膜。与现有技术相比，本专利技术具有以下效果：1、本专利技术取材多年生铁冬青良种大树，采用硬枝条作外植体进行组培育苗，难以直接诱导出不定芽，通过将枝条基部浸泡浓度ABT溶液,扦插培养后获得半木质化枝条是一种有效外植体，带菌比较少，消毒处理后获得的无菌芽的成功率比较高，无菌芽诱导率达92.7％，萌芽天数7d，萌芽条数2～3条，污染率较低，仅为15.2％。2、本专利技术选芽诱导培养基，由改良的B1培养基和生长调节剂6-BA、NAA、GA3组成，能在较短的周期内(24～32d)诱导铁冬青的带腋芽茎段分化出有效不定芽，茎段基部无异常愈伤组织产生，通过这种以芽繁芽途径获得的不定芽能有效避免继代增殖过程中出现的变异，更好地保持母株原有的优良性状。3、本专利技术选用不定芽继代增殖培养基，由改良的B1培养基和生长调节剂6-BA、NAA、GA3组成，因对B1培养基进行了改良，增加了硝酸铵和七水硫酸镁的用量，继代芽苗叶色浓绿，每株芽苗叶片数达6～10张；分化芽多，芽苗健壮、芽苗高、茎粗，一个继代周期芽苗增殖10倍左右。4、本专利技术选用生根培养基，由改良的B1培养基和生长调节剂ABT、NAA组成；选用生根方法是在无菌苗接入生根培养基前，在已灭菌的浓度20～50mg/L的ABT溶液中速蘸1～5秒，再接入生根培养基中培养，出根时间快，10～15d生根率达100％，根系发达，每株苗出根4～10条，根粗0.05～0.1cm，根系质量好，生根过程中无愈伤组织形成，为皮部生根，移栽成活率较高，可达98％。诱导生根较困难的植物，生根诱导一般采用二步生根法，第一步，接种在较高浓度生长素的培养基暗培养3～5d，第二步，移入无激素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铁冬青茎段组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)外植体获取：取半木质化枝条消毒，切成茎段，备用；/n2)芽诱导：将茎段接种到芽诱导培养基中培养得到出不定芽丛或单芽；所述芽诱导培养基包括以下组分：改良B1培养基、6-BA0.2～0.4mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、GA

【技术特征摘要】
1.一种铁冬青茎段组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)外植体获取：取半木质化枝条消毒，切成茎段，备用；
2)芽诱导：将茎段接种到芽诱导培养基中培养得到出不定芽丛或单芽；所述芽诱导培养基包括以下组分：改良B1培养基、6-BA0.2～0.4mg/L、NAA0.1～0.2mg/L、GA30.1mg/L、蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
3)芽增殖：将不定芽丛或单芽剪下，接种到芽增殖培养基中，得到无菌苗；所述芽增殖培养基包括以下组分：改良B1培养基、6-BA0.4～0.8mg/L、NAA0.2～0.4mg/L、GA30.1mg/L、活性炭0.1～0.2g/L、蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
所述改良B1培养基以1L计，包含以下组分：





2.根据权利要求1所述的铁冬青茎段组织培养方法，其特征在于：步骤1)中，所述半木质化枝条为直接从树上摘得或从树上摘取完全木质化硬枝条经扦插得到。


3.根据权利要求2所述的铁冬青茎段组织培养方法，其特征在于：扦插得到半木质化枝条的具体方法为：将铁冬青完全木质化的硬枝条剪成插条，插条浸泡在600～800mg/L的ABT溶液0.5～1h，然后将其扦插到装有基质的营养袋中，扦插基质由黄心土、泥炭土和沙组成，其重量比为2：2：1；在温度15～25℃、相对湿度60％～80％下，先在光照强度500～2000Lux、每天光照12～14h下培养10～15d，待扦插枝条有新芽长出后，保持湿温度湿度不变，提高光照强度至2000～6000Lux、每天光照12～14h，继续培养10～20d，即得半木质化枝条。


4.根据权利要求1所述的铁冬青茎段组织培养方法，其特征在于：步骤2)中，所述芽诱导培养条件为：先暗培养7～10d至腋芽萌出，然后置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：时群，陈丽文，杨利平，陈乃明，李清香，何贵整，梁刚，蔡林，黄永钦，赖崇健，李芳菲，
申请(专利权)人：钦州市林业科学研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45