利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法技术

本发明专利技术属于西瓜培育技术领域，公开了一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，包括以下步骤：将西瓜杂交种定植于田间，植株开花前1天对雌花套帽，开花当天采集植株未授粉子房存于冰盒；挑选出正常雌花的健壮子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，冲洗，酒精浸泡未授粉子房，去皮，切片，次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗；将薄片接种在诱导培养基上，热激诱导并培养得到再生材料，将再生材料接种在生根培养基上，得到组培苗；开瓶锻炼，多菌灵处理组培苗根系，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽。本发明专利技术可不经过秋水仙碱等方法，直接加倍成二倍体，解决了通过未授粉子房培养获得西瓜双单倍体诱导率低，加倍困难，移栽成活率低的问题。

【技术实现步骤摘要】
利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法
本专利技术属于西瓜培育
，涉及一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法。
技术介绍
西瓜(Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum.etNakai)为一年生草本植物，雌雄同株，异花，有夏瓜、水瓜、寒瓜等别名，因果实清甜多汁、解渴消暑等特点成为夏季主要水果之一，也是世界十大水果之一。具有丰富的营养价值和广泛用途，除用作水果鲜食外，西瓜常被用作果汁、果酒、中药、园艺观赏、家畜饲料等，是一种用途广泛的农作物。我国的西瓜育种从上世纪50年代，由最初的农家品种即常规品种，发展经历了常规品种到杂交1代品种。目前西瓜生产上98％以上的品种为杂交一代即F1。F1代品种的选育，首先需要合适的亲本即纯合自交系。目前，自交系的获得一般采用常规育种手段，通过人工连续自交、回交、复合杂交等获得纯合亲本，通常需要经过6代以上的连续自交，才能够获得稳定遗传的自交系，筛选所需时间较长，费时费力，大大限制了新品种的选育速度，已满足不了现代育种及市场的要求。而通过未授粉子房培养，可在1-2年获得纯合二倍体(DoubledHaploidBreeding，DH)，加快自交系的选育速度，进而加快新品种选育进程。目前西瓜主要也是通过未授粉子房培养获得单倍体，国内外学者也进行了许多研究，但主要是诱导出胚状体和再生植株，经自然加倍或者秋水仙素加倍成纯合双单倍体，经过筛选可以直接作为亲本材料。而由于影响西瓜未授粉子房培养成功的因素众多，存在诱导体系不稳定、诱导率低，加倍困难等原因，至今未见在西瓜育种中应用的报道(如李迎迎.西瓜未授粉子房离体培养技术的研究[D].郑州：河南农业大学,2017)(如李玲,成娟,孙小武,等.西瓜未受精胚珠的离体培养[J].中国瓜菜,2014,27(增刊):34-37)(如荣文娟.西瓜未受精胚珠离体培养研究[D].北京：中国农业科学院,2015)。因此，需要以不同基因型的西瓜为试材，对西瓜未授粉子房不同影响因素、驯化移栽条件等进行研究，构建西瓜双单倍体培养技术体系，对加快西瓜未授粉子房培养在西瓜育种上的应用，具有重要的理论和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，解决了通过未授粉子房培养获得西瓜双单倍体诱导率低，加倍困难，移栽成活率低的问题，并得到再生植株，达到在实际育种中应用的目的。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，包括以下步骤：步骤a：将西瓜杂交种定植于田间，植株开花前1天对雌花套帽，开花当天采集植株未授粉子房存于冰盒；步骤b：挑选出正常雌花的健壮子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75％的酒精浸泡未授粉子房30s，随后用清水冲洗3遍，放在滤纸上吸干水分，去皮，将子房切成厚度为0.5～1.0mm的薄片，用8.0％次氯酸钠消毒20min后，用无菌水冲洗4-5遍；步骤c：将薄片接种在诱导培养基上，37℃黑暗热激诱导3天，之后在25℃诱导培养得到再生材料，将再生材料接种在生根培养基上培养10天，得到组培苗。步骤d：开瓶锻炼6天，用0.1％多菌灵处理组培苗根系2min，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽。优选地，所述西瓜杂交种为‘郑抗10号’或‘中科6号’或‘野生128×HQ-2’。优选地，在步骤a中开花当天采集植株第5或第6节位的未授粉子房存于冰盒。优选地，在步骤b中将子房切成厚度为0.7～1.0mm的薄片。优选地，所述诱导培养基为MS培养基+0.03mg·L-1噻苯隆TDZ+2.0mg·L-1激动素KT+30mg·L-1AgNO3+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂。优选地，所述生根培养基为MS培养基+0.5mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂。优选地，所述营养钵中基质为质量比为2：1的草炭和沙土。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过对西瓜未授粉子房影响因素的研究，获得了通过西瓜未授粉子房培养双单倍体的技术体系，该体系可不经过秋水仙碱等方法，直接加倍成二倍体(纯合双单倍体再生率为87.5％)，解决了通过未授粉子房培养获得西瓜双单倍体诱导率低，加倍困难，移栽成活率低的问题，并得到再生植株，达到在实际育种中应用的目的；通过表型鉴定即可区分材料倍性和纯合性，不需要再耗费过多时间、费用来检测倍性和纯合性；本专利技术方法可适用于部分不同的基因型，不同基因型间胚诱导率为6.67％-23.33％，对基因型影响西瓜未授粉子房培养出胚率有一定指导意义。附图说明图1为不同消毒种类及时间对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响。图2为不同消毒种类及时间对西瓜未授粉子房胚珠膨大的表型影响，其中a、c：20.0％次氯酸钠消毒；b、d：8.0％次氯酸钠消毒20min；e：8.0％次氯酸钠消毒25min；f：氯化汞消毒。图3为不同切片厚度对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响。图4为不同切片厚度对西瓜未授粉子房胚珠膨大的表型影响，其中a：0.7-1.0mm；b：0.5-0.7mm；c：切片厚度1-1.5mm；d：3种切片厚度在同一培养基。图5为不同热激处理温度及时间对对西瓜未授粉子房胚珠膨大的影响。图6为TDZ对西瓜未授粉子房膨大及出胚的影响。图7为KT对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响。图8为AgNO3对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响。图9为不同基因型对西瓜未授粉子房胚珠膨大及出胚的影响。图10为不同IBA浓度及培养天数对组培苗生根的影响。图11为再生植株根尖染色体鉴定结果。图12为再生植株流式细胞仪倍性检测结果。图13为单倍体和二倍体叶片大小比较。图14为单倍体和二倍体花蕾和花瓣大小比较。图15为单倍体和二倍体田间图片。图16为8对特异性引物SSR检测结果。图17为‘野生128×HQ-2’和再生植株果实外观比较。图18为‘野生128×HQ-2’和再生植株种子形状大小色泽比较。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限定本专利技术的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。本专利技术采用Office和OriginPro9.1进行数据统计及作图。胚珠膨大率＝每皿膨大数大于等于5的片数/接种总片数×100％。出胚率＝出胚数量/接种总片数×100％。实施例一1.1试验材料以‘郑抗10号’、‘中科6号’和‘野生128×HQ-2’3个杂交种为试验材料，‘野生128×HQ-2’为野生材料和自交系材料杂交。上述3个杂交种种子来自中国农业科学院郑州果树研究所，材料特性详见表1。表1材料特性...

【技术保护点】
1.一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤a：将西瓜杂交种定植于田间，植株开花前1天对雌花套帽，开花当天采集植株未授粉子房存于冰盒；/n步骤b：挑选出正常雌花的健壮子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%的酒精浸泡未授粉子房30s，随后用清水冲洗3遍，放在滤纸上吸干水分，去皮，将子房切成厚度为0.5~1.0mm的薄片，用8.0%次氯酸钠消毒20min后，用无菌水冲洗4-5遍；/n步骤c：将薄片接种在诱导培养基上，37℃黑暗热激诱导3天，之后在25℃诱导培养得到再生材料，将再生材料接种在生根培养基上培养10天，得到组培苗；/n步骤d：开瓶锻炼6天，用0.1%多菌灵处理组培苗根系2min，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽，得再生植株。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：将西瓜杂交种定植于田间，植株开花前1天对雌花套帽，开花当天采集植株未授粉子房存于冰盒；
步骤b：挑选出正常雌花的健壮子房，去掉果柄、花瓣和绒毛，在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%的酒精浸泡未授粉子房30s，随后用清水冲洗3遍，放在滤纸上吸干水分，去皮，将子房切成厚度为0.5~1.0mm的薄片，用8.0%次氯酸钠消毒20min后，用无菌水冲洗4-5遍；
步骤c：将薄片接种在诱导培养基上，37℃黑暗热激诱导3天，之后在25℃诱导培养得到再生材料，将再生材料接种在生根培养基上培养10天，得到组培苗；
步骤d：开瓶锻炼6天，用0.1%多菌灵处理组培苗根系2min，将组培苗定植于营养钵中进行驯化移栽，得再生植株。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱迎春，孙德玺，刘君璞，安国林，李卫华，司文静，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41