固相白色不透明反射式样品池制造技术

本实用新型专利技术属于固相时间分辨荧光免疫分析技术领域，具体涉及固相白色不透明反射式样品池。它是一个有底的圆台型或圆柱型的杯状体，由基体（１）、中层（２）、内表面层（３）构成；所述的基体（１）是聚苯乙烯（ＰＳ），中层（２）是固定于基体（１）聚苯乙烯（ＰＳ）的内表面的ｎｙｌｏｎ－６膜层，内表面层（３）是与中层（２）的ｎｙｌｏｎ－６膜层以共价结合的多胺基层。以共价化学结合代替物理吸附，增大抗原或抗体的结合量，显著提高结合免疫配基的活性，使免疫检测灵敏度增强。本实用新型专利技术既可用于免疫分析，还可以用做亲和层析固相结合剂，且可以反复使用，其功能及成本均比常用的聚丙烯酰胺凝胶为优，具有广泛的应用价值。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术属于免疫分析
，具体涉及用于固相时间分辨荧光免疫分析技术的固相白色不透明反射式样品池。本技术研制的一种新型的固相白色不透明反射式样品池，可应用于荧光免疫分析、亲和层析、固相酶技术和DNA芯片等生物分析领域。自1979年Soini和Hemmila提出时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)理论，1982年创立第一台手动测量仪器以来，迄今已发展为多种TRFIA体系。其中解离增强(DELFIA)体系已经实现了商品化，但由于该体系存在着缺陷离子解离后不能产生特异的空间信号，并不适于所有的应用，如荧光成像、免疫组化、定位杂交、DNA芯片或在线检测等。为了克服DELFIA体系的不足，1988年Ether等人建立了以具有增强荧光作用的新型铕螯合剂4，7-二氯磺基苯-1，10菲啰啉2，9-二羧酸(BCPDA)作为标记物的激光激发固相时间分辨荧光免疫分析(DSLFIA)的新体系，该检测系统带有激光光源和白色不透明反射式样品池。(用新型铕螯合剂4，7-二氯磺基苯-1，10菲啰啉2，9-二羧酸(BCPDA)作为标记物的激光激发固相时间分辨荧光免疫分析，分析化学，1988，60，1069-1074。LaserExcitted Time-Resolved SolidPhase Fluoroimmunoassays with the New Europium Chelate4，7--Bis(chlorosulfophenyl)-1，10-phenanthroline-2，9-dicarboxy Acid asLabel.Anal.Chem.1988，60，1069-1074)为深入开展DSLFIA体系开创了检测系统的先河。但是由于试剂和检测系统正在完善之中，尚未达到商品化水平。有关白色不透明反射式样品池技术未见报道。尼龙(聚己内酰胺)作为可游离出自由氨基的多氨，很早就引起人们的关注。但多数研究都集中于将生物分子偶联于尼龙膜上(嗜热菌蛋白酶固定在多胺膜上，生物技术和生物工程，2003，82(2)190-199。Immobilization of Thermolysin to polyamide Nonwoven Materials.Biotechnol and Bioeng.2003，82(2)190-199.)可用于斑点免疫分析和免疫印记技术，不适合做酶联免疫分析(ELSIA)固相。关于将尼龙结合于聚苯乙烯固相的方法，有人报道预先将生物分子结合与尼龙膜上之后再覆盖于PS孔内(半抗原结合的尼龙涂布于聚苯乙烯板作为酶联免疫分析固相，免疫方法学杂志.1990，12743-49.Haptenated nyIon--coated polystyreneplates as a solid phase for ELSIA.J.Immunol Methods.1990，12743-49).该法及用该法获得的PS微孔板已被证明结合不均匀，不能耐受尼龙水解释放氨基的强酸处理以及化学偶联中的有机溶剂，导致聚苯乙烯表面被侵蚀、破坏。分析其原因是由于使用乙酸/间甲酚/二氯甲烷溶解nylon导致两个主要问题其一，二氯甲烷快速挥发，在nylon膜留下微孔，降低了膜的机械强度及对PS的结合力；其二，盐酸和有机溶剂通过微孔直接于PS接触，前者使nylon膜容易断裂，后者能溶解PS，导致PS与nylon膜混合而掩盖nylon的活性基团。故该方法只能预先结合免疫配基，再覆盖于PS表面，不具备实用价值。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，本技术提供了一种在聚苯乙烯样品池的表面固定一层白色不透明的尼龙层，经化学修饰后得到固相白色不透明反射式样品池。该固相白色不透明反射式样品池用于DSLFIA技术。本技术提供的固相白色不透明反射式样品池的结构如图1所示。它是一个有底的圆台型或圆柱型的杯状体；是由基体1、中层2、内表面层3构成；所述的基体1是聚苯乙烯(PS)，中层2是联结于基体1聚苯乙烯(PS)的内表面的nylon-6膜层，内表面层3是与中层2的nylon-6膜层以共价结合的多胺基层；所述的基体1聚苯乙烯(PS)和中层2的nylon-6膜层的联结是用吡啶/丙酮预先活化处理基体1的内表面，用乙酸/间甲酚/吡啶溶解、活化nylon-6，使两者之间发生疏水性相互作用，同时吡啶兼有活化PS和温和的“侵蚀”作用，可使nylon-6快速牢固地联结于PS内表面而形成内表面层2；对内表面层2的尼龙层进行烷基化处理，可使nylon-6表面生成的烷基-OR很容易地与2，6-二氨基己酸的一个氨基共价结合，形成另一端游离氨基的手臂，该“手臂”的游离氨基能与蛋白质的游离氨基形成较牢固的共价结合的内表面层3是多胺基层，于是得到固相白色不透明反射式样品池。下面再详细介绍本技术的制造固相白色不透明反射式样品池方法的具体步骤和条件，以便对本技术作进一步地说明。本技术所用试剂A.基体1活化剂6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液(V/V)。B.中层2的nylon-6的活化剂(0.5-0.9％吡啶)的乙酸/间甲酚溶液(V/V)。C.环氧氯丙烷的乙醚溶液环氧氯丙烷与乙醚溶液体积比为1∶9。D.三乙基氧嗡四硼酸脂(TOTFB)试剂制备40ml 5％(v/v)三氟化硼乙醚(v/v)溶液在持续搅拌下，加入12.5ml的环氧氯丙烷的乙醚溶液，在30分钟内加完，之后加热回流一小时，室温再搅拌3小时，滤出TOTFB，再用无水乙醚冲洗3次，得到的TOTFB。其产率为90％--95％以上。E.TOTFB二氯甲烷溶液含0.01-0.05g/ml TOTFB三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)二氯甲烷溶液。F.戊二醛液将0.5M戊二醛液以5％(v/v)相溶于0.2M硼酸盐缓冲溶液(pH＝7.6)。G.1，6己二胺溶液浓度为0.5M 1，6己二胺的(pH＝9.5)的碳酸盐缓冲溶液。本技术制备方法的步骤和条件1.nylon-6与PS基体1的联结向由PS基体1池内加入基体1活化剂，室温放置1-3分钟，弃去溶液后立即加入含12-18％聚酰胺-6粉的中层2nylon-6的活化剂，沿中轴线慢速旋转基体1，使nylon-6快速、坚固、均匀地结合于基体1池的内表面，形成nylon-6厚度为0.1-0.2mm的白色不透明的反射样品池中层2的膜层；2.尼龙膜表面烷基化加入TOTFB二氯甲烷溶液上述(1)的样品池中，室温放置4-10分钟，弃去，用二氯甲烷冲洗2次，用二氧六环冲洗1次；3.修饰尼龙膜表面将戊二醛溶液加入到上述(2)的样品池中，37℃温育15分钟，弃去，加入0.2M pH＝7.2磷酸盐(PBS)缓冲溶液冲洗三次，再加入1，6己二胺(pH＝9.5)溶液，室温放置3小时，倒掉，然后用PBS溶液冲洗3次，即得固相白色不透明反射式样品池。本技术的固相白色不透明反射式样品池的技术上的特点和有益的效果如下1.利用nylon-6结合于PS的内表面的白色不透明的反射样品池，采用新的溶解多氨技术和特定的PS活化剂、多氨凝固剂，使多胺均匀、牢固移植于nylon-6的表面，形成白色反射光的多胺基内层。2.该多胺内表面固相在室温暴露空气中能长期保存并能耐受强酸、碱、有机溶剂不变形、不脱落。为使nylon-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固相白色不透明反射式样品池，是一个有底的圆台型或圆柱型的杯状体，其特征在于，是由基体（１）、中层（２）、内表面层（３）构成；所述的基体（１）是聚苯乙烯（ＰＳ），中层（２）是联结于基体（１）聚苯乙烯（ＰＳ）的内表面的ｎｙｌｏｎ－６膜层，内表面层（３）是与中层（２）的ｎｙｌｏｎ－６膜层以共价结合的多胺基层。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘利华，马世盐，苏赛飞，李珍，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：实用新型
国别省市：82[中国|长春]