一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法。该方法以对绵羊肺炎支原体黏附素基因P113的C端进行克隆表达得到的重组蛋白作为抗原，利用该重组蛋白抗原致敏健康绵羊红细胞，通过对同一批血清的IHA效价筛选其最佳的致敏浓度，最佳反应条件，建立了特异性强、敏感性以及符合率高并且操作简便的绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法。可应用于兽医领域绵羊肺炎支原体的快速检测，为疾病预防、诊断和防控提供有力工具。

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法
本专利技术属于兽用生物制品检测
，具体地说，涉及一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法。
技术介绍
绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae)是一种重要的引起呼吸道疾病的病原，可导致山羊及绵羊的非典型性肺炎,绵羊肺炎支原体最早于1963年分离得到，此后在其他多个国家和地区相继发现，目前其在全球范围内分布广泛。由绵羊肺炎支原体引起的绵羊支原体肺炎在全球绵羊产业中造成非常大的经济损失。它能够与气管上皮细胞的纤毛结合并引起纤毛功能障碍，导致纤毛清除受损。此外，羊只感染绵羊肺炎支原体后，对其他如多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌以及流感病毒等病原的易感性明显增加。绵羊支原体肺炎在我国流行同样十分广泛，危害十分严重。要想有效控制绵羊肺炎支原体的感染，需要采取综合性防治措施。其中，特异的诊断技术是综合防控的关键环节之一，对于发现传染源、开展流行病学调查以及动物检疫等都具有重要的作用。血清学诊断技术，对绵羊肺炎支原体的检测一直缺乏有效的血清学技术，国内赵萍等([1]赵萍,储岳峰,高鹏程,等.绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法的建立及应用.福建农林大学学报(自然科学版),2008,37(5):510-513.[2]赵萍，逯忠新，储岳峰，等.绵羊肺炎支原体间接血凝诊断方法的建立,甘肃农业大学学报,2008,43(1):29-32.)虽然有采用全菌抗原建立ELISA方法及HA技术的报道，但绵羊肺炎支原体全菌抗原与其他感染动物的支原体之间有明显的交叉反应，因此不适用采用全菌作为抗原用于血清学诊断技术的建立。粘附素不仅是支原体重要的毒力因子，同时也是最为重要的免疫原。FalongY等(FalongY,ChengT,YongW,HuanrongZ,andHuaY.GenomesequenceofMycoplasmaovipneumoniaestrainSC01.JournalofBacteriology,2011,193(18):5018.)，首次对绵羊肺炎支原体的全基因组序列测定，并经功能预测后发现了编码粘附素的蛋白P113，并将其作为建立血清学诊断技术的重要研究对象。间接血凝试验作为一种血清型检测方法，具有较好的灵敏度和特异性，而且操作简单，不需要大型仪器，比较适用于临床中疾病的诊断和血清抗体的检测。近年来，在我国就有研究者利用牛支原体重组蛋白p48建立了检测牛支原体的间接血凝技术。也有基于重组OppA的间接血凝试验检测副猪嗜血杆菌抗体的研究报告。就目前而言，在我国养殖业集约化管理的趋势下，快速诊断的方式对于疾病的防控特别是基层具有重大意义。综上所述，对绵羊肺炎支原体感染的诊断方法分为三类：第一，病原分离鉴定，这是传统的诊断方法，也可认为是“金标准”，但由于受到一些抗生素的影响，而且支原体生长速度缓慢，对营养要求苛刻，培养周期长，导致分离培养十分困难，难作为检测方法；第二，虽然目前已建立了相应的特异性PCR技术，荧光定量PCR技术,但PCR方法需要操作人员有较高的技术水平，而且成本较高，相对仍然较为费时，也不适用于常规临床诊断和流行病学调查；第三，国内虽然有采用全菌抗原建立ELISA方法及HA技术的报道，但国外有研究表明，支原体以及副猪嗜血杆菌的全菌抗原与其他感染动物的相应病原之间有明显的交叉反应。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法，该方法通过克隆表达绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白，并以该蛋白作为抗原致敏健康绵羊红细胞，通过筛选抗原的最佳致敏浓度，以及最适的反应条件，建立特异性强，敏感性好，符合率高的绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法；该方法将操作简单不借助特殊设备，可以实现基层工作的快速检测，为疫病防控提供有力工具。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法，包括以下步骤：1)制备绵羊肺炎支原体抗原；2)制备绵羊红细胞并进行致敏处理；3)使用不同重组蛋白稀释浓度的绵羊肺炎支原体抗原致敏红细胞测定同一批血清的IHA血清效价，并确定最高血清效价所对应的抗原稀释度；4)利用步骤3)中稀释度确定间接血凝检测方法的反应条件和反应体系，建立绵羊肺炎支原体的间接血凝检测方法。可选地，步骤1)中的制备绵羊肺炎支原体抗原具体为：诱导表达纯化绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白工程菌，作为抗原，所述抗原的蛋白浓度为164μg/ml。可选地，所述步骤2)中的制备绵羊红细胞具体为：无菌采取健康绵羊颈静脉血等体积加入灭菌的阿氏液，置于4℃冰箱静置，之后用纱布过滤，3000rmp\min离心10imn，弃去上清，反复洗涤5次，配制成5％的红细胞悬液；将5％红细胞悬液于磁力搅拌器上以低转速进行搅拌，并且逐滴加入1/5体积的2.5％的戊二醛,醛化5个小时。取1：20000鞣酸加入到等体积的5％的醛化红细胞悬液中震荡混匀，37℃孵育30min，用pH6.4的PBS洗涤3次，洗涤完毕后，用PH7.2的PBS恢复到原体积，制备得到浓度为5％的绵羊红细胞。可选地，对绵羊红细胞进行致敏处理具体为：以1:20、1:40、1:80、1:160、1:320共5个稀释度用来稀释抗原,让其分别与等量5％醛化鞣酸化红细胞混合，37℃水浴致敏60min,用含1％BSA的0.15mol/LpH7.2的PBS洗2次后，再用此稀释液配成1％的致敏红细胞悬液，用此五个浓度抗原致敏的红细胞分别检测绵羊肺炎支原体的阳性血清。可选地，致敏浓度为4.1μg/ml。可选地，所述步骤3)中的抗原稀释度为1:40。可选地，步骤4)中的反应体系为50μL体系。可选地，步骤4)中的反应条件是在室温条件下反应30min。本专利技术还公开了一种由上述的方法建立的绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法在绵羊肺炎支原体检测中的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本方法特异性强，敏感性好，符合率高。2)本方法操作简单，不需要特殊设备，能检测快速，适合在基层工作中推广。3)本方法结果判断直观，肉眼可观。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术诱导表达蛋白电泳图；其中，M代表蛋白Marker，I代表诱导表达产物；图2是本专利技术蛋白浓度测定标准曲线。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1绵羊肺炎支原体抗体间接血清检测方法的建立1.材料(1)血清和菌株：绵羊肺炎支原体的阳性血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)制备绵羊肺炎支原体抗原；/n2)制备绵羊红细胞并进行致敏处理；/n3)使用不同重组蛋白稀释浓度的绵羊肺炎支原体抗原致敏红细胞测定同一批血清的IHA血清效价，并确定最高血清效价所对应的抗原稀释度；/n4)利用步骤3)中稀释度确定间接血凝检测方法的反应条件和反应体系，建立绵羊肺炎支原体的间接血凝检测方法。/n

【技术特征摘要】
1.一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备绵羊肺炎支原体抗原；
2)制备绵羊红细胞并进行致敏处理；
3)使用不同重组蛋白稀释浓度的绵羊肺炎支原体抗原致敏红细胞测定同一批血清的IHA血清效价，并确定最高血清效价所对应的抗原稀释度；
4)利用步骤3)中稀释度确定间接血凝检测方法的反应条件和反应体系，建立绵羊肺炎支原体的间接血凝检测方法。


2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1)中的制备绵羊肺炎支原体抗原具体为：诱导表达纯化绵羊肺炎支原体黏附素基因p113的C端重组蛋白工程菌，作为抗原，所述抗原的蛋白浓度为164μg/ml。


3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤2)中的制备绵羊红细胞具体为：无菌采取健康绵羊颈静脉血等体积加入灭菌的阿氏液，置于4℃冰箱静置，之后用纱布过滤，3000rmp\min离心10imn，弃去上清，反复洗涤5次，配制成5％的红细胞悬液；将5％红细胞悬液于磁力搅拌器上以低转速进行搅拌，并且逐滴加入1/5体积的2.5％的戊二醛,醛化5个小时。取1：20000鞣酸加入到等体积的5％的醛化红细胞悬液中震荡混匀，37℃孵育30m...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨发龙，王远微，刀筱芳，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川;51