D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种D‑二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。所述试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，所述抗试剂1为由异硫氰酸荧光素标记的D‑二聚体抗体1和由异硫氰酸荧光素标记的D‑二聚体抗体2抗体按照体积比1:1混合而成的溶液；所述抗试剂2为由碱性磷酸酶标记的D‑二聚体抗体3和由碱性磷酸酶标记的D‑二聚体抗体4按照体积比1:1混合而成的溶液；D‑二聚体抗体1为结合D片段表面抗原表位的抗体，D‑二聚体抗体2为结合X片段表面抗原表位的抗体，D‑二聚体抗体3为结合D片段表面抗原表位的抗体，D‑二聚体抗体4为结合Y片段表面抗原表位的抗体。本发明专利技术可以显著提高检测试剂检验结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用。
技术介绍
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统。在纤溶过程中，凝血酶在水解纤维蛋白酶原后，即相继释放出纤维蛋白肽(A和B)，剩余的可溶性纤维蛋白单体，在因子Ⅻa作用下，形成稳定的交联纤维蛋白，交联纤维蛋白在纤溶酶的降解过程中，释放的碎片进一步降解为最小片段D-二聚体。在病理状态下，凝血与纤溶系统的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强，从而纤维蛋白降解产物增加，导致D-二聚体含量增加，D-二聚体是体内存在着凝血及纤溶活性增强的重要分子标志物。因此它既可反映体内存在着血栓或继续形成的状况，又可反映体内纤溶活性增强的指标，对于临床血栓性疾病的诊断和溶栓治疗有着极其重要的价值。D-二聚体检测的基本原理均是基于抗原抗体的反应，自1983年Rylatt等最先报道了D-二聚体的单克隆抗体后，有20种D-二聚体单抗研发问世，目前有超过30种检测方法和20多种单抗被使用，但不同试剂测定同一份标本中的D-二聚体浓度往往不具有可比性，主要原因是：我们通常所说的“D-二聚体”在循环体内并不是一个结构简单均一的物质，而是含有D-二聚体结构的大小不同片段组成的混合物(如：DD、DY、XD、XY、DXD、YXD、YXY、XXD、XXY、DXXD、XXD)，分子量为190KD-720KD，不同的检测试剂一般只测定其中某种类型，而非降解片段的全部，因此各类试剂在对同一标本进行测定时，其敏感性显著不同，且在检测过程中容易出现漏检现象，因此寻求一种检验结果准确、灵敏度高的试剂盒极为重要。
技术实现思路
本专利技术提供一种结果准确、灵敏度高、检测时间短、使用方便的D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供技术方案如下：一种D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒，包括校准品、质控品、第一抗试剂、第二抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，所述磁微粒试剂为由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球；所述第一抗试剂为由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体1和由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体2按照体积比1:1混合而成的溶液；所述第二抗试剂为由碱性磷酸酶标记的D-二聚体抗体3和由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体4按照体积比1:1混合而成的溶液；其中，D-二聚体抗体1为结合D片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体2为结合X片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体3为结合D片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体4为主要结合Y片段表面抗原表位的抗体。进一步的，所述磁微粒试剂的制备步骤为：步骤1：对粒径为0.5～2μm的磁微粒进行活化，室温下搅拌30～40min后在磁场中静置1～3min，之后吸出上清液，使用缓冲液清洗，并进行悬浮，获得浓度为20～60mg/mL的第一溶液；步骤2：向所述第一溶液内加入100-500ug羊抗异硫氰酸荧光素抗体，在37℃下搅拌2～5h后在磁场中静置2～6min，吸出上清液，之后加入缓冲液并在37℃下搅拌封闭2～6小时，获得第二溶液；步骤3：使用缓冲液对所述第二溶液进行清洗3～5次，并用含有缓冲液配制成8～12mg/mL的磁性微球初溶液；步骤4：使用缓冲液对所述磁性微球初溶液进行稀释，制成磁微粒试剂，所述磁微粒试剂的浓度为0.8～2.0mg/ml。进一步的，所述磁微粒试剂的制备步骤1中使用的缓冲液为PH＝5.5～6.5，浓度为0.1-0.5mol/L的柠檬酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液中的一种或多种；和/或者：所述磁微粒试剂的制备步骤2中的缓冲液为PH＝7～8，浓度为0.1-0.5mol/L，含有质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白的磷酸缓冲液；和/或者：所述磁微粒试剂的制备步骤3中的缓冲液为PH＝7～8，浓度为0.1-0.5mol/L，体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、含质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液；和/或者：所述磁微粒试剂的制备步骤4中的缓冲液为PH＝7～8，浓度为0.1-0.5mol/L，含体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、质量体积分数为0.5-1.0％牛血清白蛋白、1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液。进一步的，所述第一抗试剂的制备步骤为：使用缓冲液对需偶联的D-二聚体抗体1和D-二聚体抗体2分别进行透析，制成D-二聚体抗体1溶液和D-二聚体抗体2溶液；使用缓冲溶液对异硫氰酸荧光素进行溶解，制成异硫氰酸荧光素溶液，使异硫氰酸荧光素溶液的浓度为2-4mg/ml；将D-二聚体抗体1溶液和D-二聚体抗体2溶液分别与异硫氰酸荧光素溶液按照100ug:1mg～200ug:1mg的比例混合均匀，并避光反应过夜，之后加NH4Cl终止反应，分别得到异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体1混合溶液和异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体2混合溶液；分别对所述异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体1混合溶液和异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体2混合溶液进行分离，得到异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体偶联物1和异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体偶联物2，之后使用抗试剂缓冲液分别对异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体偶联物1和异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体偶联物2进行稀释，之后将稀释后的异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体偶联物1和异硫氰酸荧光素-D-二聚体抗体偶联物2进行混合，得到浓度为1.5～3.0μg/ml的第一抗试剂。进一步的，所述第二抗体试剂的制备步骤为：使用缓冲液对需偶联的D-二聚体抗体3和D-二聚体抗体4分别进行透析，制成D-二聚体抗体3溶液和D-二聚体抗体4溶液；使用缓冲溶液对碱性磷酸酶进行溶解，制成碱性磷酸酶溶液，使碱性磷酸酶溶液的浓度为2-4mg/ml；将D-二聚体抗体3溶液和D-二聚体抗体4溶液分别与碱性磷酸酶溶液按照摩尔比为1:1～2:1的比例混合均匀，并加入赖氨酸溶液，反应过夜，分别得到碱性磷酸酶-D-二聚体抗体3混合溶液和碱性磷酸酶-D-二聚体抗体4混合溶液；分别对所述碱性磷酸酶-D-二聚体抗体3混合溶液和碱性磷酸酶-D-二聚体抗体4混合溶液进行分离，得到碱性磷酸酶-D-二聚体抗体偶联物3和碱性磷酸酶-D-二聚体抗体偶联物4，之后使用抗试剂缓冲液分别对碱性磷酸酶-D-二聚体抗体偶联物3和碱性磷酸酶-D-二聚体抗体偶联物4进行稀释，并将稀释后的碱性磷酸酶-D-二聚体抗体偶联物3和碱性磷酸酶-D-二聚体抗体偶联物4进行混合，得到浓度为1.0～2.0μg/ml的第二抗试剂。进一步的，所述抗试剂缓冲液的组分及含量为：进一步的，所述校准品和质控品的制备方法为：采用校准品缓冲液溶解D-二聚体，得到0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和5000ng/mL的校准品以及100ng/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、第一抗试剂、第二抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，/n所述磁微粒试剂为由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球；/n所述第一抗试剂为由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体1和由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体2按照体积比1:1混合而成的溶液；/n所述第二抗试剂为由碱性磷酸酶标记的D-二聚体抗体3和由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体4按照体积比1:1混合而成的溶液；/n其中，D-二聚体抗体1为结合D片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体2为结合X片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体3为结合D片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体4为主要结合Y片段表面抗原表位的抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、第一抗试剂、第二抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，
所述磁微粒试剂为由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球；
所述第一抗试剂为由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体1和由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体2按照体积比1:1混合而成的溶液；
所述第二抗试剂为由碱性磷酸酶标记的D-二聚体抗体3和由异硫氰酸荧光素标记的D-二聚体抗体4按照体积比1:1混合而成的溶液；
其中，D-二聚体抗体1为结合D片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体2为结合X片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体3为结合D片段表面抗原表位的抗体，D-二聚体抗体4为主要结合Y片段表面抗原表位的抗体。


2.根据权利要求1所述的D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂的制备步骤为：
步骤1：对粒径为0.5～2μm的磁微粒进行活化，室温下搅拌30～40min后在磁场中静置1～3min，之后吸出上清液，使用缓冲液清洗，并进行悬浮，获得浓度为20～60mg/mL的第一溶液；
步骤2：向所述第一溶液内加入100-500ug羊抗异硫氰酸荧光素抗体，在37℃下搅拌2～5h后在磁场中静置2～6min，吸出上清液，之后加入缓冲液并在37℃下搅拌封闭2～6小时，获得第二溶液；
步骤3：使用缓冲液对所述第二溶液进行清洗3～5次，并用含有缓冲液配制成8～12mg/mL的磁性微球初溶液；
步骤4：使用缓冲液对所述磁性微球初溶液进行稀释，制成磁微粒试剂，所述磁微粒试剂的浓度为0.8～2.0mg/ml。


3.根据权利要求2所述的D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂的制备步骤1中使用的缓冲液为PH＝5.5～6.5，浓度为0.1-0.5mol/L的柠檬酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液中的一种或多种；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤2中的缓冲液为PH＝7～8，浓度为0.1-0.5mol/L，含有质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白的磷酸缓冲液；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤3中的缓冲液为PH＝7～8，浓度为0.1-0.5mol/L，体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、含质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤4中的缓冲液为PH＝7～8，浓度为0.1-0.5mol/L，含体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、质量体积分数为0.5-1.0％牛血清白蛋白、1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液。


4.根据权利要求1所述的D-二聚体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述第一抗试剂的制备步骤为：
使用缓冲液对需偶联的D-二聚体抗体1和D-二聚体抗体2分别进行透析，制成D-二聚体抗体1溶液和D-二聚体抗体2溶液；
使用缓冲溶液对异硫氰酸荧光素进行溶解，制成异硫氰酸荧光素溶液，使异硫氰酸荧光素溶液的浓度为2-4mg/ml；
将D-二聚体抗体1溶液和D-二...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝树彬，谢清华，郭宣城，赵凤，李静，王珍，
申请(专利权)人：山东博科诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37