狼疮抗凝物确认试剂盒（凝固法）制造技术

本发明专利技术涉及临床诊断技术领域，具体公开了一种基于dRVVT法的狼疮抗凝物确认试剂。本发明专利技术所述确认试剂包括缓冲液、大豆磷脂、蝰蛇毒激活剂RVV‑X、钙、肝素中和剂、稳定剂，还含有Zn

【技术实现步骤摘要】
狼疮抗凝物确认试剂盒(凝固法)
本专利技术涉及临床诊断
，更具体的说是涉及一种基于dRVVT法的狼疮抗凝物确认试剂盒。
技术介绍
狼疮抗凝物(Lupusanticoagulants，LA)是一种磷脂依赖的病理性循环抗凝物质，为IgG或IgM的异质性免疫球蛋白。主要通过结合β2糖蛋白Ⅰ(β2-glycoproteinⅠ，β2-GPⅠ)、人凝血酶原(prothrombin，PT)及其他磷脂复合物来干扰磷脂依赖的凝血过程，使凝血时间延长。LA因在系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)患者中首先发现而得名，可见于抗磷脂抗体综合征(Antiphospholipidsyndrome，APS)，SLE，结缔组织疾病等多种自身免疫疾病，与APS患者动静脉血栓和病态妊娠密切风险相关。LA检测不仅可以预测血栓的发生，还可以判断预后，因此，血浆中LA含量检测对血栓性疾病的早期诊断、病程监测及对溶栓药物的治疗监测等方面具有重要的临床意义。LA检测的适应症主要包括以下几类：高风险患者包括：1)50岁以下患者发生无明确原因的动静脉血栓2)罕见部位发生血栓3)孕晚期流产4)自身免疫疾病(SLE、类风湿关节炎、自身免疫血小板减少症、自身免疫性血溶性贫血等)患者发生血栓或病态妊娠。中等风险患者包括：1)偶然发生的APTT延长2)孕早期反复流产3)年轻患者血栓形成低风险患者包括：1)年长患者发生动静脉血栓形成由于抗体的异质性，不同的凝血检测方法可以检测同一患者中的不同抗体群体。而狼疮抗凝物检测试剂的种类，磷脂构成和浓度，检测原理的不同(如磁珠法与光学法、散射光与透射光)，以及不同的终点判断方式等均会影响到检测结果。近年来已发展了多种LA的检测方法，其中，应用最广的是凝固法。根据凝血途径的不同，凝固法检测分为以下三种途径：外源途径(稀释的凝血酶原时间(diluteprothrombintime，dPT)、组织促凝血酶原激酶抑制(tissuethromboplastininhibition，TTI)、激活七种狼疮抗凝物(activatedsevenlupusanticoagulant，ASLA))、内源途径(活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，APTT)，以及基于APTT的试验如，高岭土凝血时间KCT(kaolinclottingtime)、二氧化硅凝血时间(silicaclottingtime，SCT)、血小板中和试验PNP(plateletneutralizationprocedure)、六角相磷脂中和试验HPNT(hexagonalphasephospholipidneutralizationtest))和共用途径(dRVVT、蛇静脉酶凝血时间Ecarintime、Textarin蛇毒凝血时间Textarintime等)。根据澳大利亚皇家病理学院(theRoyalCollegeofPathologistsofAustralasia。RCPA)和美国病理学家协会(CollegeofAmericanPathologists，CAP)室间质评报告显示基于内源性途径/共同途径的APTT和基于共同途径原理改良蝰蛇毒磷脂时间dRVVT是全球临床实验室最常采用的两种检测方法。EQA(externalqualityassessment)项目调查结果发现，相对于其他检测方法，dRVVT在检测LA样本方面提供了更好的一致性结果。在APS的筛查中，因为dRVVT可以检测到大部分的β2GPI依赖的LA抗体，因此比KCT更密切地与血栓形成相联系。dRVVT比APTT、KCT、dPT特异性更强，因为它只涉及共同途径的因素(凝血因子X、V、II、纤维蛋白原)，因此它对于X因子以上的凝血级联的因子缺陷或特定的因子抑制剂(如因子VII、VIII、IX、XI和接触因子)不敏感。高水平的VIII因子(如妊娠)可能缩短APTT结果，并可能掩盖处于LA边缘的患者，而dRVVT则不受影响。CLSI(美国临床和实验室标准协会)于2014年发布的最新的指南指出，目前没有“金标准”(国际标准)可用于评估和比较LA分析。由于LA抗体的异质性，不同的凝血检测方法可以检测同一患者中的不同抗体群体，因此，不同的检测方法的诊断的特异性和敏感性尤其重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于dRVVT(diluteRusselvipervenomtest)法的狼疮抗凝物确认试剂，使得所述确认试剂能够提高检测的敏感性；本专利技术的另外一个目的在于提供一种包含上述确认试剂的狼疮抗凝物确认试剂盒(凝固法)。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于dRVVT法的狼疮抗凝物确认试剂，包括缓冲液、大豆磷脂、蝰蛇毒激活剂RVV-X、钙、肝素中和剂、稳定剂，还含有Zn2+盐或Mn2+盐；所述Zn2+的浓度为0.3～0.5mM，所述Mn2+的浓度为0.5～1.0mM。。现有技术中的检测原理是，在钙存在下，RVV-X激活剂可直接激活因子X，导致血浆凝固，筛选试剂中磷脂含量较低，LA的存在使筛选试验凝固时间延长，而确认试剂中高浓度的磷脂可以中和LA，使凝血时间恢复正常。经过本专利技术的研究发现，在原有的确认试剂中加入Zn2+和/或Mn2+，能够提高原有确认试剂检测的敏感性。在本专利技术具体实施方式中，所述Zn2+的浓度为0.3mM、0.4mM或0.5mM，所述Mn2+浓度为0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1.0mM。本专利技术所述Zn2+盐和Mn2+盐包括但不限于Zn2+和Mn2+的氯化物、硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐等。dRVVT法的确认试剂一般包括缓冲液、磷脂、蝰蛇毒激活剂RVV-X和钙，试剂中磷脂的类型和浓度都会影响检测的敏感性，现有技术中常用的磷脂类型有动物磷脂如牛脑磷脂以及合成磷脂，各种磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的比例均不同，对狼疮抗凝物的敏感性也有差异，本专利技术比较了大豆磷脂和牛脑磷脂，发现大豆磷脂有更好的敏感性，且大豆磷脂的来源更广泛，大豆磷脂的浓度优选1～50μg/mL，更优选25-50μg/mL。作为优选，所述缓冲液选自pH6.5～8.0的Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液、Hepes(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基乙磺酸)缓冲液、咪唑缓冲液中的任意一种或两种以上，更优选pH7.30的50mM的Tris-HCl缓冲液。为了进一步确保缓冲效果的一定的离子强度，可在缓冲液中添加一定浓度的无机盐，如100～200mM的NaCl，优选浓度为150mM。作为优选，蝰蛇毒凝血因子X激活剂RVV-X，浓度范围0.1～1U/mL，优选浓度为0.2U/mL。钙可以是10～40mM的葡萄糖酸钙、乳酸钙或氯化钙，浓度进一步优选25mM的氯化钙。作为优选，所述肝素中和剂为0.1～5μg/mL的鱼精蛋白或聚凝胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种狼疮抗凝物确认试剂，其特征在于，包括缓冲液、大豆磷脂、蝰蛇毒激活剂RVV-X、钙、肝素中和剂、稳定剂，还含有Zn

【技术特征摘要】
1.一种狼疮抗凝物确认试剂，其特征在于，包括缓冲液、大豆磷脂、蝰蛇毒激活剂RVV-X、钙、肝素中和剂、稳定剂，还含有Zn2+盐或Mn2+盐；所述Zn2+的浓度为0.3～0.5mM，所述Mn2+的浓度为0.5～1.0mM。


2.根据权利要求1所述确认试剂，其特征在于，所述缓冲液选自pH6.5～8.0的Tris-HCl缓冲液、Hepes缓冲液、咪唑缓冲液中的任意一种或两种以上。


3.根据权利要求2所述确认试剂，其特征在于，所述缓冲液为pH7.30的50mM的Tris-HCl缓冲液，其中包含150mM的NaCl。


4.根据权利要求1所述确认试剂，其特征在于，所述大豆磷脂浓度为1～50μg/mL。


5.根据权利要求1所述确认试剂，其特征在于，所述蝰蛇毒激活剂RVV-X的浓度为0.1～1U/mL。

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永华，管瑞静，
申请(专利权)人：上海太阳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31