超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法技术

本发明专利技术涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗血小板药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗血小板药物的定量分析，为临床上抗血小板药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法
本专利技术属于血浆检测
，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，具体药物为：替格瑞洛(Ticagrelor，TIC)、去羟乙氧基替格瑞洛(DeshydroxyethoxyTicagrelor，DHTIC)、阿司匹林(Acetylsalicylicacid，ASA)、水杨酸(Salicylicacid，SA)、氯吡格雷(Clopidogrel，CLOP)和氯吡格雷羧酸代谢物(ClopidogrelCarboxylicAcid，CLOPC)。
技术介绍
阿司匹林是一种常用的非甾体类药物，最初被用于解热镇痛，后来研究发现小剂量使用阿司匹林可以对血小板的聚集产生抑制作用，使血小板的粘附率降低，从而阻止血栓的形成，口服阿司匹林75mg被作为预防用药，被广泛用于缺血性心血管疾病的预防，同时低剂量使用时可用于心梗患者。作为预防用药常常需要长期使用，研究发现长期使用阿司匹林会增加出血、减少中性粒细胞等风险。阿司匹林在体内可以迅速代谢为水杨酸，导致体内阿司匹林含量较低，两种化合物浓度相差太大也给同时检测两种化合物造成很大的困难。传统的LC-MS方法和LC-UV的方法均不能同时检测两种物质。LC-MS/MS方法可以同时检测到体内的两种化合物。替格瑞洛(TIC)是一种环戊基三唑嘧啶类药物，是一种独特的血小板聚集抑制剂，对P2Y12受体具有强效抑制作用，对ADP(二磷酸腺苷)诱导的血小板聚集反应能产生可逆的抑制作用，且具有一定的浓度依赖性。常被用于治疗抗血小板、降低胆固醇、控制血糖、控制血压等。TIC及其主要代谢物去氧乙基替格瑞洛(DHTIC)均表现出抗血小板特性，30-40％的吸收剂量的主要代谢物多为患者耐受良好，常被报道不良反应包括头晕、恶心、胸痛、呼吸困难和出血。与他汀类药物联用时可能会导致肌肉相关不良事件的风险增加。但是，与其他药物联合应用可能会有一定的效果导致危及生命的相互作用。因此,调查这些化合物的浓度在临床样本是必要的，因此需要开发一种同时测定TIC、及其代谢物的足够精确的方法。氯吡格雷(CLOP)是一种噻吩并吡啶类衍生物，可以选择性的抑制二磷酸腺苷(ADP)与血小板受体的结合及继发ADP介导的糖蛋白GPI-Ib/IIIa复合物的活化，还能阻断其他种类胡激动剂通过释放ADP引起胡血小板活性的增强，最终达到抑制血小板聚集的目的。常被应用于中风近期发作的患者，以及心肌梗死肯确诊外周动脉疾病的患者，最终减少动脉粥样硬化事件的发生。氯吡格雷是一种前体药物，原形药物没有活性，前体药物主要经过肝脏进行代谢，其羧酸类代谢物(CLOPC)在血浆中药物相关化合物的85％，最高浓度出现时间约为在服药后1h出现，氯吡格雷及其代谢物在不同个体间浓度差异较大，因此需要进行准确的药物浓度监测。目前综合分析国内外文献和专利，对这几种抗血小板药物的检测只是同时检测一种或者两种化合物，尚无同时检测这六种化合物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法。本专利技术的技术方案如下：一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，所述抗血小板药物分别为：替格瑞洛(TIC)、去羟乙氧基替格瑞洛(DHTIC)、阿司匹林(ASA)、水杨酸(SA)、氯吡格雷(CLOP)和氯吡格雷羧酸代谢物(CLOPC)；上述抗血小板药物对应的同位素内标物分别为：替格瑞洛-d7(TIC-d7)、去羟乙氧基替格瑞洛-d7(DHTIC-d7)、阿司匹林-d4(ASA-d4)、水杨酸-d4(SA-d4)和氯吡格雷-d4(CLOP-d4)；采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗血小板药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗血小板药物的含量，具体色谱条件为：(1)超高效液相色谱条件：流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；色谱柱型号：WatersBEHC18(2.1×100mm，1.7μm)；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至40:60；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至95:5；(2)质谱条件：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本专利技术在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗血小板药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗血小板药物的分离和检测。在不影响本专利技术效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.001％～0.005％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.004％甲酸水溶液。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本专利技术采用0.001％～0.01％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：WatersBEHC18(2.1×100mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本专利技术分别采用替格瑞洛-d7(TIC-d7)、去羟乙氧基替格瑞洛-d7(DHTIC-d7)、阿司匹林-d4(ASA-d4)、水杨酸-d4(SA-d4)和氯吡格雷-d4(CLOP-d4)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中抗血小板药物时的重现性、准确度均较好。在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。更进一步地，进样体积为1～5μL，优选为1μL。在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，/n所述抗血小板药物分别为：替格瑞洛、去羟乙氧基替格瑞洛、阿司匹林、水杨酸、氯吡格雷和氯吡格雷羧酸代谢物；/n上述抗血小板药物对应的同位素内标物分别为：替格瑞洛-d7、去羟乙氧基替格瑞洛-d7、阿司匹林-d4、水杨酸-d4和氯吡格雷-d4；/n采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗血小板药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗血小板药物的含量，具体色谱条件为：/n(1)超高效液相色谱条件：/n流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；/n色谱柱型号：Waters BEH C18；/n采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至40:60；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至95:5；/n(2)质谱条件：/n在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。/n...

【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，
所述抗血小板药物分别为：替格瑞洛、去羟乙氧基替格瑞洛、阿司匹林、水杨酸、氯吡格雷和氯吡格雷羧酸代谢物；
上述抗血小板药物对应的同位素内标物分别为：替格瑞洛-d7、去羟乙氧基替格瑞洛-d7、阿司匹林-d4、水杨酸-d4和氯吡格雷-d4；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗血小板药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗血小板药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：WatersBEHC18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至40:60；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至95:5；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.001％～0.005％甲酸水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为35～45℃；进样体积为1～5μL。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.004％甲酸水溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1μL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物血浆。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5；更优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:4。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，李美娟，
申请(专利权)人：南京品生医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32