一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法技术

本发明专利技术提供一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，前处理操作简单、快捷、样本用量少、分析时间短，5min之内可完成血浆中5种常见抗肿瘤药物的分离和检测；采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量；可同时满足临床上高通量样本检测需求，为临床上联合应用提供药动学参考。

【技术实现步骤摘要】
一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法
本专利技术属于血浆检测
，具体涉及一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，具体抗肿瘤药物为：甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(7-hydroxyMethotrexate，HMTX)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)、紫杉醇(Paclitaxel，PCT)和多西他赛(Docetaxel，DCT)。
技术介绍
治疗药物监测(TDM)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种方法。通过定量测定血液中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。因此，治疗药物的监测至关重要。传统的微生物法费时且烦琐；而免疫分析法成本昂贵，专一性差，难以实现高通量检测，关键问题由于代谢产物的存在，抗体可能交叉反应使测定结果偏高。甲氨蝶呤(MTX)是一种叶酸还原酶抑制剂，为叶酸类抗肿瘤药物，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖。临床上广泛用于治疗急性淋巴细胞性白血病、骨肉瘤、恶性淋巴瘤等。7-羟基甲氨蝶呤为MTX的主要代谢产物，研究表明，7-OHMTX体内浓度水平与大剂量MTX给药后的急性肝脏毒性相关，所以同时监测MTX和7-OHMTX具有重要的临床意义。氟尿嘧啶(5-FU)是一种常用的抗代谢类抗肿瘤药物，该药需较长时间与肿瘤组织接触才能发挥抑制及杀灭肿瘤细胞的作用，确保有效的血药浓度是治疗的关键。而5-FU在杀灭肿瘤细胞的同时对机体正常细胞也具杀伤作用，若剂量使用不当，可致临床疗效不佳或发生骨髓抑制等严重毒性反应。因此，开展5-FU治疗药物浓度监测对临床合理用药有着重要的指导意义。多西他赛(DCT)又名多烯紫杉醇，和紫杉醇(PCT)的作用相同，是一类从短叶紫杉树皮中提取的天然产物，通过与肿瘤细胞的微管蛋白结合，促进微管蛋白形成稳定的微管，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖。临床上对乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌及卵巢癌等多种实体瘤具有较好的抑制活性。根据调研，以上抗肿瘤药物的检测方法主要有高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)和LC-MS/MS。HPLC-UV法专属性较差、灵敏度较低、样本用量大，且分析时间长，而LC-MS/MS法多采用液液萃取法处理血浆，操作繁琐和耗时。比如，中国专利(CN105424843A)公开了“一种测定多西他赛或紫杉醇的高效液相色谱-三重四级杆质谱联用方法”，该专利技术建立了ESI(-)和APCI(-)两种电离模式的质谱方法，采用液液萃取法处理样本，经过了萃取、氮吹和复溶的步骤，极大地增加了前处理时间。再比如，中国专利(CN110320302A)公开了一种“快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法”，该专利技术使用LC-MS/MS法虽前处理简单，但只测定了MTX的浓度，未监测主要代谢物7-OHMTX，而同时监测MTX和7-OHMTX才具有重要的临床意义。中国专利(CN110927297A)公开了“一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法”，该方法同时检测了13种抗肿瘤药物，但前处理复杂，需要蛋白沉淀后干燥处理再复溶后过滤，中国专利(CN110045048A)公开了“一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物浓度的HPLC-MSMS方法”，检测种类有限，且前处理采用蛋白沉淀后氮吹复溶，前处理复杂，这些方法在临床应用比较受限。
技术实现思路
本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法。本专利技术的技术方案如下：一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，所述抗肿瘤药物分别为：甲氨喋呤(MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PCT)和多西他赛(DCT)；上述抗肿瘤药物对应的同位素内标物分别为：甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、紫杉醇-d5(PCT-d5)和多西他赛-d5(DCT-d5)；血浆样本中加入含内标的蛋白沉淀剂，涡旋振荡，离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗肿瘤药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗肿瘤药物的含量，具体色谱条件为：(1)超高效液相色谱条件：流动相A：0.05％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；色谱柱型号：ACQUITYUPLCHSST3(2.1×100mm,1.8μm)；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1；每个样品采集时间为5min；(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本专利技术在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗肿瘤药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗肿瘤药物的分离和检测。在不影响本专利技术效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本专利技术采用0.05％～0.2％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：ACQUITYUPLCHSST3(2.1×100mm,1.8μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本专利技术分别采用甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、紫杉醇-d5(PCT-d5)和多西他赛-d5(DCT-d5)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，/n所述抗肿瘤药物分别为：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛；/n上述抗肿瘤药物对应的同位素内标物分别为：甲氨喋呤-d3、7-羟基甲氨蝶呤-d3、氟尿嘧啶-13C,15N2、紫杉醇-d5和多西他赛-d5；/n采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗肿瘤药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗肿瘤药物的含量，具体色谱条件为：/n(1)超高效液相色谱条件：/n流动相A：0.05％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；/n色谱柱型号：ACQUITY UPLC HSS T3；/n采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1；每个样品采集时间为5min；/n(2)质谱条件：/n在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，
所述抗肿瘤药物分别为：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛；
上述抗肿瘤药物对应的同位素内标物分别为：甲氨喋呤-d3、7-羟基甲氨蝶呤-d3、氟尿嘧啶-13C,15N2、紫杉醇-d5和多西他赛-d5；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗肿瘤药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗肿瘤药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.05％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITYUPLCHSST3；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1；每个样品采集时间为5min；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为35～50℃；进样体积为0.2～10μL。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.1％甲酸水溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1μL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物血浆。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为异丙醇与乙腈混合溶液；优选地，所述蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:1～3，更优选地，所述蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:2。

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【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，李美娟，
申请(专利权)人：南京品生医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32