C型肝炎病毒感染病的诊断试剂制造技术

本发明专利技术提供能够高灵敏度且迅速测定多个检测样品的ＨＣＶ感染病诊断试剂及其诊断方法。其中Ｃ型肝炎病毒感染病诊断试剂是通过用固相使ＨＣＶ抗原或ＨＣＶ抗原与载体蛋白通过化学结合调制成的复合抗原致敏后得到的。其诊断方法是将该诊断试剂添加到检测样品中，测定载体粒子的凝集度。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用免疫凝集反应检测C型肝炎病毒(HCV)感染病的诊断试剂。1988年美国的Chiron Corporation的研究组首先于病毒中发现了HCV基因。为了检测该HCV的抗体，进行了各种重组抗原和合成多肽的研究，开发了检测与HCV相关的抗体的试剂盒。而作为检测方法主要有琼脂凝胶扩散法、对流免疫电泳法、放射免疫测定法、酶免疫测定法、被动红细胞凝集法、胶乳凝集法等方法。为了检测与HCV相关的抗体所用的HCV抗原蛋白质，其中作为结构域蛋白有人们已知的核心和被膜蛋白，而作为非结构域蛋白质有NS1～NS5蛋白质。若只用一种HCV抗原蛋白质，检测灵敏度不是特别高，特异性上也有问题，所以要将结构域和非结构域的蛋白质适当组合起来使用(Proc.Natl.Acad.Soi.USA 8910011-10015，1992)。并且也进行了为进一步提高检测灵敏度的试验。例如，在粒子凝集法中有时要使致敏的HCV抗原数进一步增加，有时对有HCV抗原活性的多肽进行加热处理(特开平6-1002273号)，或者是使HCV抗原蛋白质和载体蛋白质的融合蛋白质用亲水性粒子致敏后再用于试验(特开平7～198723号)。虽然也曾尝试用合成多肽作抗原，但一般来说使用合成多肽时检测灵敏度降低。因此，需要能高灵敏度且迅速测定多个检测样品的HCV感染病的诊断试剂以及诊断方法。为达到上述目的，进行了深入的研究，结果发现，利用戊二醛法将载体蛋白质和各种C型肝炎病毒的核心抗原、NS3抗原、NS4抗原以及NS5抗原通过化学结合调制成复合抗原，然后用载体粒子使复合抗原致敏，这样可以提高灵敏度，同时通过使用复合抗原也可大幅度地改善粒子的稳定性。本专利技术提供了用固相使HCV抗原、HCV抗原与载体蛋白质通过化学结合调制的复合抗原致敏后得到的C型肝炎病毒感染病的诊断试剂。作为载体蛋白质，只要是水溶性蛋白质，没有特别的限制。理想的载体蛋白质的分子量是10,000～1,000,000，更理想的是30,000～150,000之间的蛋白质，具体讲，最合适的是牛血清清蛋白(BSA)、卵清清蛋白、血蓝蛋白等。另外，还可以使用水溶性的合成高分子，如聚乙二醇、葡聚糖等。作为固相可使用载体粒子、微型血凝反应盘、试管等。最好是用载体粒子。作为载体粒子，可使用通常粒子凝集法的诊断试剂中用的公知的粒子。例如，可以使用象聚苯乙烯胶乳那样的疏水性粒子，以及粒子表面含有氨基、羧基等亲水基团的共聚合粒子、红细胞、明胶粒子等。最理想的是用聚苯乙烯胶乳。在本专利技术的诊断试剂中使用的HCV抗原蛋白质是众所周知的结构域蛋白质和非结构域蛋白质。作为结构域蛋白质可以使用核心蛋白质，作为非结构域蛋白质可使用NS3蛋白质、NS4蛋白质和NS5蛋白质。有关这些抗原蛋白质的氨基酸和核苷酸序列在文献(特表平5-508219号)中已有记载。至于抗原蛋白质的来源，只要它有HCV抗原活性，并不受特别限制。即可以使用从天然分离的蛋白，也可使用化学合成的，以及通过基因重组制造出来的蛋白质。作为抗原蛋白质可以使用上述范围内的蛋白质中的各种长度的多肽。最好是用含有至少一个抗原决定簇的由8个以上氨基酸组成的多肽。最理想的是用分子量为1,000～5,000的合成多肽。多肽的合成可利用本专业中众所周知的方法，例如固相合成法、片段缩合法、或是用经典的溶液合成法进行。理想的方法是文献(Merrifield.J.Am.Chem.Soc.852149，1963)记载的固相多肽合成法。而本专利技术中，核心、NS3、NS4、NS5合种抗原蛋白质，通过组合，这种组合是至少含有一个以上的不同抗原决定簇的1种以上的抗原蛋白质的组合，组合的抗原蛋白可直接地用载体粒子致敏，或是与载体蛋白结合，以复合抗原的形式用载体粒子致敏。后面叙述的实施例中作为核心抗原使用的是包含特表平5-508219号记载的核心区内氨基酸序列中49-68的多肽，作为NS4多肽使用的是含有特表平5-508219号记载的NS4区内氨基酸序列中1706～1725、1718～1739以及1724～1743的多肽，而作为NS5多肽使用的是含有特表平5-508219号记载的NS5区内氨基酸序列中的2287-2306、2299～2318，以及2311～2330的多肽，而作为NS3抗原使用的是含有特表平5～508219号记载的NS3区内氨基酸序列中的1192～1457的多肽，但本专利技术并不受此限制。将上述各种抗原蛋白质与载体蛋白通过化学键结合后制成复合抗原。发现用载体粒子使复合抗原致敏后其检测灵敏度比直接用载体粒子使抗原蛋白质致敏后的检测灵敏度高。但是，本专利技术中使用的象NS3那样的分子量在10,000以上的抗原没有观察到显著的差别。因此，可以直接用载体粒子使象NS3那样的抗原蛋白质致敏，也可以与其它抗原蛋白质结合以复合抗原形式用载体粒子致敏。载体蛋白与抗原蛋白质的结合可以采用众所周知的方法，例如可以使用碳二亚胺法、过碘酸法、马来酰亚胺法、戊二醛法等方法。通过戊二醛搭桥可增大反应性，所以最理想的是用戊二醛法。调制复合抗原时，载体蛋白与抗原蛋白质的分子数比大约是1∶3～1∶20，理想的是大约1∶4～1∶9，最理想的比例大约是1∶6～1∶8。利用众所周知的方法，将这样调制的复合抗原与载体粒子结合(致敏)。例如可通过物理吸附、或化学吸附结合。如上所述，NS3抗原不只是与载体蛋白质形成复合抗原后用载体粒子致敏，也可以直接用载体粒子致敏，这可以用同样的方法致敏。致敏是在有缓冲作用的缓冲液中进行的，例如可使用磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液，理想的pH是3-8，最理想的pH是pH4-5。本专利技术还提供C型肝炎病毒感染病的诊断方法，其特征是将上述的C型肝炎病毒感染病诊断试剂加到检测样品中，用流式细胞仪测定载体粒子的凝集程度。本专利技术的C型肝炎病毒感染病诊断试剂，在检测样品中若存在HCV抗体就可与它反应引起凝集。产生的凝集可以目视，或通过浊度、吸光度等进行测定。若使用应用了流式细胞仪原理的全自动免疫凝集测定装置(例如东亚医用电子社制的PAMIA-30TM)通过光学手段测定凝集粒子的大小，其测定迅速，而且灵敏度和精度都高。即通过鞘流机构将样品导入流动室，排成一列通过，用激光照射，通过测定散射光的强度就可知道凝集的程度，给出凝集的粒子数(PPolymer)和未凝集的粒子数(MMonomer)，由P和M推算出P/T(T＝P+M)，根据予先得到的临界值判断有无HCV抗体。利用这一方法可使HCV抗体的检测灵敏度更高。而如果使粒径变成合适的粒径，通过采用了电阻法的血液分析装置或粒度分析装置进行测定也是有可能的。但若考虑到检测器的堵塞等问题，最好还是用光学方法测定。若使用本专利技术的C型肝炎病毒感染病诊断试剂，则不仅诊断灵敏度高，而且可以比市售的诊断试剂更早期地诊断出有无感染。就是说，在使用下列一组血清作试验时，这组血清是同一个人的HCV抗体阳性化过程中随时间的推移采集的数个样品(例如产生HCV抗体的系列血清，进口商协和医学、制造商BOSTON BIOMEDICA.INC)。试验的结果表明本专利技术的C型肝炎病毒感染病诊断试剂与以往采用的使用红细包的被动血球凝集法(PHA)、酶免疫检测法(EIA)以及酶联免疫吸附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｃ型肝炎病毒感染病诊断试剂，是用固相使ＨＣＶ抗原、ＨＣＶ抗原与载体蛋白通过化学结合调制的复合抗原致敏得到的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：高浜洋一，白石顺一，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]