(1→3)-β-葡聚糖结合性蛋白质、识别该蛋白质的抗体及其利用制造技术

通过将鲎血球提取液进行亲和层析处理和凝胶过滤可得到的、分子量约为５８０ｋＤａ（非还原条件下的凝胶过滤）和约为１７０ｋＤａ（还原条件下的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）的（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖结合性蛋白质或其变体，选择性识别它们的抗体，用这些蛋白质和抗体检出试样中的（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖的方法，用结合了这些蛋白质的载体从样品中除去（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖的方法，可用于试样或样品中所含的内毒素、（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖的检出或（１→３）－β－Ｄ－葡聚糖的除去。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从鲎的血球得到的(1→3)-β-D-葡聚糖结合性蛋白质或其变体及其抗体。本专利技术还涉及由这些蛋白质组成的(1→3)-β-D-葡聚糖的测定剂、由这些蛋白质和该测定剂组成的药盒、由这些蛋白质和该抗体组成的药盒，以及使用这些蛋白质的(1→3)-β-D-葡聚糖的测定方法。本专利技术还涉及这些蛋白质或结合这些蛋白质的载体组成的(1→3)-β-D-葡聚糖的除去剂及使用该除去剂的(1→3)-β-D-葡聚糖的除去方法。本专利技术还进一步涉及使用这些蛋白质的鲎变形细胞溶胞产物中存在的G因子活化的抑制方法。本专利技术还更进一步涉及使用这些蛋白质的内毒素测定方法。
技术介绍
1964年，有人发现鲎血球提取液(变形细胞溶胞产物，以下称作LAL)可被极微量的革兰氏阴性(G-)菌内毒素(以下称作内毒素(Et)或脂多糖(LPS))凝固(凝胶化)，迄今已阐明与Et(LPS)敏感因子(C因子)起始的凝胶化有关的多个因子(丝氨酸蛋白酶前体)。据报告，该反应由类似于哺乳动物凝血系统的连锁反应机制组成，在其它无脊椎动物也存在同样的机制。另一方面，已知LAL除了Et外也与极微量的(1→3)-β-D-葡聚糖(以下也称作β-葡聚糖)反应引起凝胶化，也发现识别β-葡聚糖的敏感因子(G因子)。而且，也阐明了通过和C因子介导的途径(C因子系统)完全不同的途径(G因子系统)的凝固机制，可诱导Et同样的凝胶化。因为β-葡聚糖也是真菌细胞壁的结构多糖，所以也可进一步推测此途径具有与C因子系统同样的对机体防御的密切关系。作为β-葡聚糖结合性蛋白质，迄今报告了鲎的血液凝固G因子〔FEBS Lett.，129，318-321(1981)〕、蚕的β-葡聚糖识别蛋白质(プロフェノ-ル氧化酶)〔J.Biol.Chem.，263，12056-12062(1988)〕、人单核细胞的β-葡聚糖受体〔J.Exp.Med.，173，1511-1520(1991)〕、局部调理素化时的补体受体〔J.Immunol.，124，3307-3315(1985)〕、对植物细胞的β-葡聚糖ェリシタ-〔J.Cell Biol.，78，627(1978)〕、来自Streptococcus sobrinus的葡聚糖结合性蛋白质〔Infect.Immun.，60(12)5291-5293(1992)〕、来自ツヅリガ的β-葡聚糖特异性植物凝集素〔Matha V.，64，35-42(1990)〕等。专利技术的揭示本专利技术者对LAL中凝固化因子进行研究的结果，发现LAL中存在与β-葡聚糖特异性结合、抑制β-葡聚糖激活G因子的蛋白质，并分离了这种蛋白质。本专利技术者还发现了选择性识别这种蛋白质的抗体。而且，研究了这些蛋白质或抗体的性质，发现了其用途。即、本专利技术的课题是提供这样的特异性结合于β-葡聚糖的新型蛋白质及其抗体，将其应用于β-葡聚糖和内毒素的检出、β-葡聚糖的去除或用作真菌感染治疗药。即、本专利技术为得自鲎血球、精制成在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中显示单一区带的、具有如下理化性质的β-葡聚糖结合性蛋白质。(1)分子量约580kDa(非还原条件下的凝胶过滤)约170kDa(还原条件下的SDS-PAGE)(2)等电点约9.2(3)紫外吸收光谱280nm处具有最大吸收(4)溶解性易溶于水(5)物质的颜色白色且N末端氨基酸序列如下所示。Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro-Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp-Phe-Asn-(式中，Xaa表示存在于自然界的任何氨基酸)。而且，本专利技术中也包含上述蛋白质的变体。本专利技术中的变体为与上述蛋白质功能相同的物质，通过取代、缺失或追加该蛋白质的氨基酸而对其功能无实质性影响的物质。更进一步，较好的是，本专利技术中的变体其氨基酸序列具有高度相同性，意味着所要求的效果与该蛋白质实质上相同的蛋白质(以下称包括这些变体的蛋白质)。本专利技术还进一步涉及如下所述的抗体、使用这些抗体的葡聚糖测定剂、测定盒及葡聚糖测定方法。(1)选择识别上述蛋白质的抗体。(2)由上述蛋白质或标记的上述蛋白质组成的(1→3)-β-D-葡聚糖测定剂。(3)由上述蛋白质和上述抗体或标记的上述抗体组成的(1→3)-β-D-葡聚糖测定盒。(4)由上述蛋白质和上述测定剂组成的(1→3)-β-D-葡聚糖测定盒。(5)以上述蛋白质和试样中的(1→3)-β-D-葡聚糖反应形成复合物、检出该复合物为特征的(1→3)-β-D-葡聚糖的测定方法。(6)上述(5)中所述的测定方法，即采用所述抗体或标记的或可标记的抗体进行上述复合物的检出。(7)(1→3)-β-D-葡聚糖的测定方法，其特征在于将试样中的(1→3)-β-D-葡聚糖固定在固相上，或以可形成固相的上述蛋白质和该标记蛋白质挟持，形成三明治状复合物，上述蛋白质为可固定于固相的物质时，将该复合物固定于固相上，将固相与液相分离后，测定任一相的标记物质。本专利技术进一步还涉及从含有这样的葡聚糖的样品中除去葡聚糖的葡聚糖除去剂及除去方法。(8)上述蛋白质或固定蛋白质的载体组成的(1→3)-β-D-葡聚糖除去剂。(9)(1→3)-β-D-葡聚糖的除去方法，其特征在于将上述蛋白质或固定于上述载体上的上述蛋白质与样品中的(1→3)-β-D-葡聚糖反应，形成复合物，从样品中分离除去该复合物。本专利技术还进一步涉及G因子活化的抑制方法。(10)上述蛋白质与鲎变形细胞溶胞产物混合，或样品与上述蛋白质混合后、该样品与鲎变形细胞溶胞产物混合组成的该鲎变形细胞溶胞产物中存在的G因子的活化的抑制方法。本专利技术还进一步涉及内毒素的测定方法。(11)内毒素的测定方法，其特征在于用采用鲎变形细胞溶胞产物的鲎反应测定含(1→3)-β-D-葡聚糖的样品中所含的内毒素时，在鲎反应之前，将样品与上述蛋白质混合，或将该溶胞产物与上述蛋白质混合。本专利技术的β-葡聚糖结合性蛋白质(以下也称GBP)可应用通常用于鲎变形细胞溶胞产物配制的低渗液提取法，从鲎Tachypleus tridentatus、Tachypleus gigas、Limulus polyphemus、Carcinoscorpius rotundicauda等的血球(变形细胞)中提取〔例如，参照J.Biochem.，80，1101-1021(1976)〕。具体地为在鲎的血球中，加入冷却至0-4℃的0.02M Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，于0-4℃搅拌，提取。将提取液冷却、离心，得到上清液(溶胞产物)。在此溶胞产物中含有プロクロツテイング酶(Pro CE)、凝固蛋白原(coagulogen)、G因子、B因子、C因子、GBP、抗LPS因子等各种凝血系统因子。溶胞产物上以0.02-0.05MTris-盐酸缓冲液(pH7.0-8.5)(含有0-0.2M NaCl)平衡过的CL-6B亲和柱(以硫酸右旋糖酐、琼脂糖CL-6B(Pharmacia制)，用已知的方法(Anal.Biochem.60本文档来自技高网...

【技术保护点】
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示单一区带的、具有如下理化性质的与（１→３）β－Ｄ－葡聚糖特异性结合的蛋白质或其变体（１）分子量：约５８０ｋＤ（非还原条件下的凝胶过滤）约１７０ｋＤ（还原条件下的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）（２）等电点：约９．２ （３）紫外吸收光谱：２８０ｎｍ处具有最大吸收（４）溶解性：易溶于水（５）物质的颜色：白色。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：田村弘志，田中重则，
申请(专利权)人：生化学工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]