猪异种抗原的鉴定制造技术

本文提供了遗传修饰的猪、猪器官、组织和细胞，其在异种移植后在人对象中导致排斥反应的倾向性较低。具体地，本文提供了缺少非Gal异种抗原的遗传修饰的猪，和适于移植到人中的从这种遗传修饰的猪获得的猪细胞、组织和器官。本文还提供了改善人对象中排斥相关症状的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】猪异种抗原的鉴定相关申请的交叉引用本申请要求2018年1月30日提交的美国临时申请第62/623,571号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
技术介绍
已经产生了经过遗传修饰(即转基因，遗传工程改造)以去除主要的异种反应性抗原(“异种抗原”)的猪，例如去除αGal，N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc，也称为Hanganutziu-Deicher抗原)，和B4GalNT2相关聚糖的三重敲除。然而，未知的异种抗原仍然存在，这意味着来自这种转基因猪的异种移植器官可能会诱导受体的排斥(例如，急性或急性体液排斥)。因此，在本领域中仍然需要缺少异种反应性抗原的遗传修饰的猪细胞和组织，所述异种反应性抗原对临床异种移植形成了关键的障碍。
技术实现思路
在第一方面，本文提供了一种转基因猪，其基因组包含遗传修饰，其导致破坏的猪CD37(pCD37)基因和破坏的猪CD81(pCD81)基因中的一个或多个。由于所述遗传修饰，与野生型猪相比，在转基因猪中不存在可检测水平的pCD37和pCD81蛋白之一或两者。当将来自所述转基因猪的组织移植到人中时，与将来自野生型猪的组织移植到人中时相比，排斥相关症状得到改善。在某些情况下，转基因猪的基因组还包含一些遗传修饰，这些修饰导致相对于缺少对基因组的所述修饰的猪细胞而言功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶(αGT)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2)的任何表达缺失，与缺乏所述遗传修饰的猪相比，转基因猪表现出降低的αGal抗原，Neu5GC抗原和B4GalNT2抗原水平。与来自野生型猪的细胞相比，转基因猪的细胞与人免疫球蛋白的结合减少。在另一方面，本文提供获自本文描述的转基因猪的猪器官，组织或细胞。猪的器官，组织或细胞可以选自皮肤，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺和小肠或其部分。在另一方面，本文提供了遗传修饰的猪细胞，其包含对猪细胞的基因组的修饰，其导致以下一种或多种：(i)缺乏功能性pCD37的任何表达(pCD37KO)和(ii)缺乏功能性pCD81的任何表达(pCD81KO)，其中相对于缺乏所述遗传修饰的猪细胞，所述遗传修饰的猪细胞与人免疫球蛋白的结合减少。所述遗传修饰的猪细胞可进一步包含对所述猪细胞的基因组的修饰，其导致相对于缺少对基因组的所述修饰的猪细胞功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶(αGT)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2)的任何表达缺失，其中经修饰的猪细胞与缺乏所述遗传修饰的猪细胞相比显示出降低的αGal抗原水平，降低的Neu5GC抗原水平和降低的B4GalNT2抗原水平。在另一方面，本文提供了衍生自遗传修饰的细胞的转基因猪。另外，本文提供了从遗传修饰的猪获得的猪器官，组织或细胞。猪的器官，组织或细胞可以选自皮肤，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺、小肠或其部分。在另一方面，本文提供了一种改善人对象中排斥相关症状的方法，该方法包括将具有降低的pCD37抗原水平和降低的pCD81抗原水平的猪移植材料移植到需要移植的人对象中，其中与将来自野生型猪的猪移植材料移植到人对象中相比，排斥相关症状得到改善。排斥相关症状可以选自细胞排斥反应相关症状，体液排斥反应相关症状，超急性排斥相关症状，急性体液异种移植反应排斥相关症状和急性血管排斥反应相关症状。附图说明当考虑以下的详细描述时，本专利技术将被更好地理解，并且除了上述内容之外的特征，方面和优点将变得显而易见。这样的具体实施方式参考了以下附图，其中：图1显示了猪(p)pCD37和pCD81。CMV启动子用于产生pCD37和pCD81的载体。图2证明了在用pCD37和pCD81转染的HEK293T细胞中的外源表达。48小时后裂解转染的细胞。Western印迹显示pCD37和pCD81在这些细胞上的表达。图3证明人IgG/IgM与HEK293T细胞上的pCD37和pCD81的结合。图4表示在图3的HEK293T细胞上与pCD37和pCD81结合的人IgG/IgM的平均荧光强度(MFI)比。图5证明了pCD37和pCD81的野生型或Gal敲除(GalKO)猪成纤维细胞的过表达。图6证明了人IgG与过表达pCD37和pCD81的野生型猪成纤维细胞的结合。图7证明了人IgG与过表达pCD37和pCD81的GalKO猪成纤维细胞的结合。图8证明了猪CD37序列的同种型。图9显示了pCD37基因中的CRISPR/Cas9诱导的突变。图10证明了人IgG与四联基因敲除(GGTA1/CMAH/B4GALNT2/CD37)肝衍生细胞(LDC)的结合。尽管本专利技术可以进行大量的改变和采用替代形式，但在附图和以下详述中以示例的方式显示了本专利技术的示例性实施方式。但是应当理解，示例性实施方式的描述并不旨在将本专利技术的范围限制在所揭示的特定形式，反之，本专利技术应涵盖所附权利要求书所限定的本专利技术范围内的所有变化、等价形式和替代形式。具体实施方式说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请通过引用纳入本文，如同它们完全示于本申请中那样。本文提供的转基因动物，器官，组织和细胞至少部分基于专利技术人对新猪四跨膜蛋白作为非Gal异种反应抗原的鉴定和表征。四跨膜蛋白在细胞和体液免疫反应中起重要作用，与关键的白细胞受体相互作用，包括MHC(主要组织相容性复合物)分子，整联蛋白，CD4/CD8T细胞和B细胞受体复合物。本文所述的遗传修饰动物及其猪器官，组织和细胞的优点包括，包含遗传修饰以敲除一个或两个新近鉴定的猪四跨膜蛋白的转基因动物所呈现的可能诱发超急性排斥(HAR)以及猪到人移植中的其他异种移植排斥问题的异种反应性抗原较少。因此，作为解决异种移植供体动物器官短缺的方法，转基因猪具有广阔的前景。另外，本文所述的遗传修饰的猪适合于临床试验，并提供了用于研究非Gal异种反应性抗原在对猪到人异种移植的免疫应答和凝血应答中的作用的动物模型。因此，在第一方面，本文提供了遗传修饰的猪细胞，其中遗传修饰包含对猪细胞的基因组的修饰，其导致以下一种或多种：(i)缺乏功能性pCD37的任何表达(pCD37KO)和(ii)缺乏功能性pCD81的任何表达(pCD81KO)，其中相对于缺乏所述遗传修饰的猪细胞，所述遗传修饰的猪细胞与人免疫球蛋白的结合减少。在某些实施方式中，经遗传修饰以缺乏功能性pCD37和/或pCD81表达的猪细胞被进一步遗传修饰以缺乏其他异种反应性抗原的表达。例如，在某些情况下，产生三，四或五基因敲除转基因猪是有利的，其中其基因组已被遗传修饰以突变或敲除编码pCD37和pCD81的基因(例如pCD37/pCD81双敲除)和编码α-1，3-半乳糖基转移酶-1(GGTA1)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β4GalNT2)的基因中的一个或多个。α-1，3-半乳糖基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因猪，其基因组包含遗传修饰，所述遗传修饰导致破坏的猪CD37(pCD37)基因和破坏的猪CD81(pCD81)基因中的一个或多个，与野生型猪相比，无可检测水平的pCD37和pCD81蛋白之一或二者，并且与当将来自野生型猪的组织移植到人中时相比，当将来自所述转基因猪的组织移植到人中时，排斥相关症状得到改善。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180130 US 62/623,5711.一种转基因猪，其基因组包含遗传修饰，所述遗传修饰导致破坏的猪CD37(pCD37)基因和破坏的猪CD81(pCD81)基因中的一个或多个，与野生型猪相比，无可检测水平的pCD37和pCD81蛋白之一或二者，并且与当将来自野生型猪的组织移植到人中时相比，当将来自所述转基因猪的组织移植到人中时，排斥相关症状得到改善。


2.如权利要求1所述的转基因猪，其基因组还包含一些遗传修饰，这些修饰导致相对于缺少对基因组的所述修饰的猪细胞而言功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶(αGT)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2)的任何表达缺失，与缺乏所述遗传修饰的猪相比，转基因猪表现出降低的αGal抗原，Neu5GC抗原和B4GalNT2抗原水平。


3.如权利要求1所述的转基因猪，其中，与来自野生型猪的细胞相比，所述转基因猪的细胞与人免疫球蛋白的结合减少。


4.从如权利要求1所述的转基因猪获得的猪器官、组织或细胞。


5.如权利要求4所述的猪器官、组织或细胞，其中，所述猪器官、组织或细胞选自皮肤，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺和小肠或其部分。


6.一种遗传修饰的猪细胞，其中所述遗传修饰包含对猪细胞的基因组的修饰，其导致以下一种或多种：(i)缺乏功能性pCD37的任何表达(pCD37KO)和(ii)...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·艾克瑟，
申请(专利权)人：印第安纳大学研究和科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US