茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法技术

本发明专利技术涉及一种茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法，其中，酶解制备方法包括：预处理步骤；茶籽蛋白质提取步骤；茶籽多肽制备步骤；茶籽多肽含量测定步骤。本发明专利技术以油茶籽粕为原料，首先采用复合酶辅助提取其中的蛋白质，其次采用蛋白酶水解茶籽蛋白，获取小分子茶籽多肽，并在蛋白酶筛选、单因素影响测定实验基础上，以多肽得率为指标，设计响应面试验对胰蛋白酶酶解茶籽蛋白制取茶籽多肽工艺进行了优化，选取最优工艺参数，使多肽得率达到74.99％，并通过抗氧化活性测试结果表明，通过酶水解方法制备的多肽比原茶籽蛋白抗氧化性更好。

【技术实现步骤摘要】
茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法
本专利技术涉及多肽制备
，特别涉及一种茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法。
技术介绍
油茶籽是山茶科山茶属常绿小乔木(CamelliaoleiferaAbel)的成熟种子，在衰老茶园、有性繁殖茶园、群体品种茶园的产量可年产60万-100万吨。茶籽粕是茶籽经过榨油处理后的渣饼，在化工、农业、食品等方面利用广泛。油茶籽粕中的主要成分是多糖类、茶皂素、粗蛋白、淀粉和茶多酚等，茶籽蛋白可作为一种色氨酸营养强化剂应用到食品中。有研究表明，蛋白质原料经水解得到的多肽混合物具有比原料蛋白及氨基酸混合物更优越的食品加工性能及营养价值，而且多肽制品通常具有一定的生理保健功能，如抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等。但目前利用油茶籽进行多肽提取和制备工艺的研究仍处于初级阶段，多肽得率较低，难以进行推广应用
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法，具有提高多肽得率的优点。为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种茶籽多肽的酶解制备方法，包括：预处理步骤：对油茶籽粕进行脱脂处理后，在60℃的温度条件下进行烘干、粉碎，过60目筛后，获得油茶籽粕粉；茶籽蛋白质提取步骤：取油茶籽粕粉加水调制成浆，加入酶制剂进行酶解处理后，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后再次离心处理，取沉淀物冷冻干燥，获得茶籽蛋白，并测定茶籽蛋白的含量；茶籽多肽制备步骤：取茶籽蛋白用去离子水溶解，调节pH后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得茶籽多肽液；茶籽多肽含量测定步骤：取5.0mL茶籽多肽液，加入5.0mL10％的三氯乙酸水溶液，混匀后静置10min，在4000rpm的转速条件下离心15min，去除其中的蛋白质及大分子长链肽段，再取6.0mL上清液，以Gly-Gly-Tyr-Arg为标准品，采用双缩脲法测定上清液中的茶籽多肽含量，并按照标准公式计算多肽得率。作为本专利技术的一种优选方案，所述茶籽蛋白质提取步骤中酶制剂为总加酶量300U/g的α-淀粉酶：漆酶为3：2，且料液比为1:25g/mL、pH为5.0，酶解处理过程温度为35℃，酶解处理时长为60min。作为本专利技术的一种优选方案，所述茶籽蛋白质提取步骤中测定茶籽蛋白的含量具体包括：精确称取干燥的茶籽蛋白，用去离子水溶解后，转移至250mL容量瓶中，加水定容，采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标品，以测定茶籽蛋白浓度。作为本专利技术的一种优选方案，所述茶籽多肽含量测定步骤中标准公式为：多肽得率＝水解液中的茶籽多肽量/茶籽蛋白质量×100％。作为本专利技术的一种优选方案，还包括单因素影响测定步骤，所述单因素影响测定步骤包括：蛋白酶筛选步骤、加酶量对比测定步骤、反应温度对比测定步骤、pH对比测定步骤、以及反应时长对比测定步骤。作为本专利技术的一种优选方案，所述蛋白酶筛选步骤具体包括：按照所述茶籽多肽制备步骤中的操作方式依次以胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶作为蛋白酶在40℃的温度下进行酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各蛋白酶的酶解处理效果；所述加酶量对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在温度为60℃、pH为8.0的条件下，依次加入100U/g、300U/g、500U/g、900U/g的酶量，进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各加酶量的酶解处理效果；所述反应温度对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700U/g、pH为8.0的条件下，依次在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各温度条件的酶解处理效果；所述pH对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700U/g、温度为60℃的条件下，依次在pH为5、6、7、8、9、10的条件下进行3h的酶解处理，并通过测定多肽得率以确定各pH值的酶解处理效果；所述反应时长对比测定步骤具体包括：以固定料液比1：25，在加酶量为700U/g、温度为60℃、pH为8.0的条件下进行连续6h的酶解处理，每间隔1h取样一次，并通过测定多肽得率以确定各反应时长下的酶解处理效果。作为本专利技术的一种优选方案，所述单因素影响测定步骤之后还包括四因素三水平响应面试验，所述四因素三水平响应面试验具体包括：以温度、反应时长、pH、总加酶量为条件变量进行响应面试验，并根据试验结果以多肽得率为响应值，构建条件变量与响应值之间的数学模型并进行方差分析。作为本专利技术的一种优选方案，所述四因素三水平响应面试验之后还包括：根据试验结果建立响应值与其中任意两个条件变量之间的响应曲面图和等高线图。另一方面，本专利技术还提供一种茶籽多肽抗氧化活性测定方法，包括取上述任一技术方案所述的制备方法制得的茶籽多肽分别进行DPPH自由基清除活性实验、羟基自由基清除活性实验和ABTS自由基清除活性实验。另一方面，本专利技术还提供一种茶籽多肽，由上述任一技术方案所述的所述的制备方法制得。综上所述，本专利技术与现有技术相比具有如下有益效果：本专利技术实施例通过提供一种茶籽多肽及其酶解制备方法、抗氧化活性测定方法，以油茶籽粕为原料，首先采用复合酶辅助提取其中的蛋白质，其次采用蛋白酶水解茶籽蛋白，获取小分子茶籽多肽，并在蛋白酶筛选、单因素影响测定实验基础上，以多肽得率为指标，设计响应面试验对胰蛋白酶酶解茶籽蛋白制取茶籽多肽工艺进行了优化，选取最优工艺参数，使多肽得率达到74.99％，并通过抗氧化活性测试结果表明，通过酶水解方法制备的多肽比原茶籽蛋白抗氧化性更好。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例一中不同蛋白酶对茶籽蛋白水解效果的对比图。图2为本专利技术实施例一中不同加酶量对多肽得率的影响曲线图。图3为本专利技术实施例一中不同酶解温度对多肽得率的影响曲线图。图4为本专利技术实施例一中不同PH对多肽得率的影响曲线图。图5为本专利技术实施例一中不同酶解时长对多肽得率的影响曲线图。图6为本专利技术实施例一中温度与PH的响应面分析图。图7为本专利技术实施例一中温度与加酶量响应面分析图。图8为本专利技术实施例一中时间与pH响应面分析图。图9为本专利技术实施例一中加酶量与时间响应面分析图。图10为本专利技术实施例一中加酶量与pH响应面分析图。图11为本专利技术实施例一中温度与时间响应面分析图。图12为本专利技术实施例一中茶籽蛋白和茶籽多肽的DPP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茶籽多肽的酶解制备方法，其特征在于，包括：/n预处理步骤：对油茶籽粕进行脱脂处理后，在60℃的温度条件下进行烘干、粉碎，过60目筛后，获得油茶籽粕粉；/n茶籽蛋白质提取步骤：取油茶籽粕粉加水调制成浆，加入酶制剂进行酶解处理后，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后再次离心处理，取沉淀物冷冻干燥，获得茶籽蛋白，并测定茶籽蛋白的含量；/n茶籽多肽制备步骤：取茶籽蛋白用去离子水溶解，调节pH后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得茶籽多肽液；/n茶籽多肽含量测定步骤：取5.0mL茶籽多肽液，加入5.0mL10％的三氯乙酸水溶液，混匀后静置10min，在4000rpm的转速条件下离心15min，去除其中的蛋白质及大分子长链肽段，再取6.0mL上清液，以Gly-Gly-Tyr-Arg为标准品，采用双缩脲法测定上清液中的茶籽多肽含量，并按照标准公式计算多肽得率。/n

【技术特征摘要】
1.一种茶籽多肽的酶解制备方法，其特征在于，包括：
预处理步骤：对油茶籽粕进行脱脂处理后，在60℃的温度条件下进行烘干、粉碎，过60目筛后，获得油茶籽粕粉；
茶籽蛋白质提取步骤：取油茶籽粕粉加水调制成浆，加入酶制剂进行酶解处理后，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，再将上清液的pH调至等电点后再次离心处理，取沉淀物冷冻干燥，获得茶籽蛋白，并测定茶籽蛋白的含量；
茶籽多肽制备步骤：取茶籽蛋白用去离子水溶解，调节pH后加入蛋白酶于恒温下进行酶解处理，用沸水灭酶5min，在8000rpm的转速条件下离心处理10min，取上清液以获得茶籽多肽液；
茶籽多肽含量测定步骤：取5.0mL茶籽多肽液，加入5.0mL10％的三氯乙酸水溶液，混匀后静置10min，在4000rpm的转速条件下离心15min，去除其中的蛋白质及大分子长链肽段，再取6.0mL上清液，以Gly-Gly-Tyr-Arg为标准品，采用双缩脲法测定上清液中的茶籽多肽含量，并按照标准公式计算多肽得率。


2.根据权利要求1所述的茶籽多肽的酶解制备方法，其特征在于，所述茶籽蛋白质提取步骤中酶制剂为总加酶量300U/g的α-淀粉酶：漆酶为3：2，且料液比为1:25g/mL、pH为5.0，酶解处理过程温度为35℃，酶解处理时长为60min。


3.根据权利要求1或2所述的茶籽多肽的酶解制备方法，其特征在于，所述茶籽蛋白质提取步骤中测定茶籽蛋白的含量具体包括：
精确称取干燥的茶籽蛋白，用去离子水溶解后，转移至250mL容量瓶中，加水定容，采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标品，以测定茶籽蛋白浓度。


4.根据权利要求1所述的茶籽多肽的酶解制备方法，其特征在于，所述茶籽多肽含量测定步骤中标准公式为：多肽得率＝水解液中的茶籽多肽量/茶籽蛋白质量×100％。


5.根据权利要求1所述的茶籽多肽的酶解制备方法，其特征在于，还包括单因素影响测定步骤，所述单因素影响测定步骤包括：蛋白酶筛选步骤、加酶量对比测定步骤、反应温度对比测定步骤、pH对比测定步骤、以及反应时长对比测定步骤。


6.根据权利要求5所述的茶籽多肽的酶解制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵世光，谢东宝，姜东，王洲，钱森和，丁佳红，魏明，
申请(专利权)人：安徽工程大学宣城产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34