人尿中高密度脂蛋白含量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术产品技术领域。本发明专利技术公开了一种人尿中高密度脂蛋白含量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法。本发明专利技术的试剂盒经临床试验结果表明能判断肾病患者的病情轻重以及预后。方法简便快速，特异性强，灵敏度高，有较好的临床应用前景。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术产品，具体涉及一种人尿中低密度脂蛋白(High density lipoprotein HDL)含量的酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法。本专利技术提供了一种HDL含量酶免试剂盒，该试剂盒是用抗体HDL(IgG)包被，抗体HDL(IgG)联接辣根过氧化物酶为检测抗体的夹心法，检测人尿中的HDL含量。并由下列试剂组成①HDL抗体IgG预包被板1块②HDL抗体IgG酶标记液1瓶③HDL标准(2500、1250、625、56、10、0ng/ml)各1瓶④浓缩洗涤液1瓶⑤底物液冲液甲、乙各1瓶⑥终止液1瓶本专利技术的另一所要解决的技术问题是提供了上述尿中HDL含量的ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤一、原材料及其规格正常人血清动物新西兰大白兔，健康雄性，体重2～3kg超速离心机日立牌80-P-7型，RPZ-48T区带转子，RPS-50-2水平转子密度梯度形成仪，日立牌，DGP-2型Unic紫外分光度计SP-800型酶联免疫测定仪Labosystems Dragon Multiskan MK3UV754分光光度计旋涡混合器，XW-80型PHS-20型精密酸度计电泳仪(上海)酶标板，华东理工大学 ELISA测定CV％(％)＜10％辣根过氧化物酶(RZ3.0，SigMA)NaIO4A.R(进口分装)NaBH4A.R(进口分装)其他试剂Na2HPO4·12H2O A.R柠檬酸 A.RNacl A.R甘油 化学纯H2O2A.RTween-20 化学纯邻苯二胺 化学纯H2SO4A.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定High Density lipoprotein，HDL标准品(SigMA)二、包被抗体HDL多克隆抗体的制备(一)区带密度梯度离心纯化HDL操作流程本文参考Hinton(1976)区带密度梯度离心法，但做了较大改进。使用日立30-P-7离心机，RPZ-48T转子做区带离心。先用阿贝折射仪，将NaBr梯度液配制成密度为1.4的液体，然后将密度为1.4的NaBr和密度为1.0的蒸馏水经密度梯度形成仪由边孔加区带转子内，此时转速维持在2800/rpm。加至中孔有梯度液流出时，再经边孔用恒流泵注入密度为1.4的人血清50ml。待血样全部加入后，将转速上升至42000/rpm离心18小时后共得到四个峰，由中孔收样，样品流经Unic紫外分光光度计测得四个脂蛋白组分峰。其中第一个峰呈乳白色，集中在第一管，为极低密度脂蛋白(vLDL)。其余几个峰均呈浅黄色，分别为低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。其余系去脂血清，含其他杂蛋白高峰。将收集到的峰，选主峰顶部数管不可太宽，以免混入中间密度脂蛋白(IDL)。(二)脂蛋白抗血清HDL的制备按常规制备蛋白质抗血清制备法。首先用纯化的HDL溶于0.01MPH7.4磷酸缓冲液中，加等量的福氏完全佐剂乳化后，给新西兰大白兔，颈背部多点及脚垫内注射2.0mg，为基础免疫。每两周加强一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价满意者，由心脏抽血收集抗血清，抗血清再经硫酸铵两次盐析(50％及33％饱和(NH4)SO4)分步沉淀纯化成兔抗人(HDL)抗体IgG(简称HDL抗体IgG)。(三)酶标兔抗人HDL抗体IgG交联物的制备。经纯化所得的兔抗人HDL抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠法交联获得“酶标抗体IgG”。试剂配制和操作步骤如下1.过碘酸钠标记法试剂(1)0.06M NaIO4(0.13克NaIO4，加水至10ml)(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml(3)NaBH4(5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml)(4)0.05M PH9.5碳酸盐缓冲液甲液无水碳酸钠10.6克加水至500ml乙液无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml(5)0.02M PH7.4 PBS(用0.1M PH7.4 PBS稀释)2.过碘酸标记法的操作步骤7.5mg HRP+0.5ml蒸馏水溶解↓加0.06M NaIO40.5ml，混合后置4℃，30分钟↓加0.16M乙二醇0.5ml室温30分钟↓加mg/ml的兔抗脂蛋白抗体HDL IgG 0.5ml(约含HDL抗体IgG 7mg)，混合后装透析袋，用0.05M，pH9.6碳酸缓冲液透析过液↓次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小时↓吸出上述结合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃ 30’后，离心4000转/分×15分钟弃上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析过液，换液三次，每次1000ml↓次日，再离心除去不溶物即得“酶标抗体IgG”，分装于安瓿中密封后，置-40℃保存(四)脂蛋白HDL酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法的操作步骤尿样原液包被稀释液Na2CO30.16克，NaHCO32.9克，NaN30.02克，加水至100ml成为pH9.6碳酸盐缓冲液。样品稀释液NaCL 8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，KCL0.2克，T ween-20 0.5ml，NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成为pH7.4PBS-Tween20样品稀释液。洗涤液Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成为pH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗涤液。基质液0.1M Na2HPO45.14ml(3.6克Na2HPO4加水100ml)，0.05M柠檬酸4.86ml(1克柠檬酸加水100ml)邻苯二胺4mg，3％H2O20.05ml成为基质液。双抗体夹心法操作程序0.1ml抗体HDL IgG包被(20μg/ml IgG 4℃过夜)↓洗涤0.1ml样品(0.1ml尿原液)(37℃2小时)0.1ml脂蛋白标准液HDL标准品(SigMA进口)0-2500ng/ml↓洗涤0.1ml酶标抗体IgG(1∶2000)(37℃2小时)↓洗涤0.1ml基质液(邻苯二胺4mg溶于10ml)柠檬酸磷酸氢(37℃ 10分钟)二钠缓冲液加3％H2O20.05ml)↓0.05ml 3M H2SO4终止反应↓490nm测OD值(DG3022酶联免疫测定仪)↓计算含量(五)分离和纯化的脂蛋白HDL的鉴定经区带离心和纯化的脂蛋白HDL应用琼脂糖免疫双扩散结果显示出HDL为单一沉淀线，证明抗原已经纯化，再经0.22μ除菌滤膜过滤除菌。分别用Lowry氏法测定蛋白质含量做抗原。做免疫原时需新鲜制备品。(六)抗体IgG的鉴定经两次盐析纯化的HDL抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果，HDL为单一沉淀线。(七)标准曲线的制备倍比稀释的HDL(SigMA进口)标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图。曲线呈“S”型，灵敏度良好，HDL-蛋白质(HDL-P)最低检测量约为100μg。标准曲线测定HDL-P含量范围为100-1000ng/ml。均在正常人含量波动范围之内。在ELISA双抗体夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好。(八)精密度试验为了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人尿中高密度脂蛋白的含量酶联免疫吸附试验试剂盒，其特征在于该试剂盒是由下列试剂组成的： ①ＨＤＬ抗体ＩｇＧ预包被板１块 ②ＨＤＬ抗体ＩｇＧ酶标记液１瓶 ③ＨＤＬ标准（２５００、１２５０、６２５、５６、１０、０ｎｇ／ｍｌ）各１瓶 ④浓缩洗涤液１瓶 ⑤底物液冲液甲、乙各１瓶 ⑥终止液１瓶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜凤鸣，
申请(专利权)人：杜凤鸣，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]