一种抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成的苦楝果提取物的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成的苦楝果提取物的制备方法和应用。经试验证明，本发明专利技术的苦楝果提取物在含量为0.5‑1.0g/mL能有效抑制铜绿假单胞菌浮游菌的生长及其生物膜的形成，在含量为0.25‑0.5g/mL对铜绿假单胞菌浮游菌的抑制效果较差，但能较好抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。本发明专利技术的原材料天然环保，抑菌抑膜效果显著，有益于人体健康。苦楝果提取物可应用于制备清洗压疮、糖尿病足溃疡、下肢动静脉溃疡等慢性伤口、疥疮、头癣、湿疮、湿疹痛痒等的药物、食品保鲜防腐剂或日化产品抗菌剂。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成的苦楝果提取物的制备方法和应用
本专利技术属于医药、日化、植物和微生物领域，具体涉及一种抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成的苦楝果提取物的制备方法和应用。
技术介绍
化学杀菌剂长期大量以及不正当使用使得很多微生物对其产生了不同程度的抗药性，与此同时，化学杀菌剂的残留也会对人类健康造成威胁，因此，化学杀菌剂在很多领域受限受禁，这促使科研人员从现有的具优异杀菌功能的天然植物和中草药中挖掘更多的活性成分。特别是从黄花蒿中提取到有效抑制疟疾的青蒿素的屠呦呦教授获得诺贝尔生理学或医学奖，以及在新型冠状病毒防治过程中，中草药制剂和疗法多次出现在诊疗方案中，这些必定会将我国的天然产物抑菌抑病毒研究和开发利用推向新的高潮。而截止目前，科研人员已发现全世界约1600种以上的植物含有杀菌、杀虫、抗病毒功效物质，其中研究较多的是楝科植物，主要包括苦楝、川楝和印楝。苦楝在我国黄河以南各省区较常见。诸多文献报道了苦楝对多种微生物有抑菌、杀菌、驱虫、杀虫、抗病毒、抗肿瘤等多重活性。有学者研究发现苦楝树乙醇提取液对黑曲霉、绿色木霉有很好的抑菌活性，苦楝浸剂对黄色毛癣菌、同心性毛癣菌、许兰氏黄藓菌、奥杜盎氏小芽孢癣菌、铁锈色小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌、红色皮肤癣菌、星形奴卡氏菌等均有一定的抑菌效果。细菌生物膜(Bacterialbiofilm,BF)是细菌的一种生存形式，有数据表明在自然界中高达95％的细菌都是以细菌生物膜的形式存在，它是一种附着于生物或非生物材料表面，被自身分泌的胞外大分子包裹并具有一定三维结构特点的细菌群体。由于生物膜的形成，从而导致细菌抗药性的产生，有研究表明，细菌生物膜的抗药性比其在浮游状态高10～1000倍。细菌生物膜的形成还会导致很多的危害，如对附着的材料表面产生腐蚀作用、污染医疗器械和引发人类疾病等。慢性伤口细菌生物膜就是细菌附于伤口床，与自身分泌的细胞外基质成分相互融合形成的一种膜状组织，慢性伤口因持续时间长、影响因素多而易发感染甚至形成难以处理的细菌生物膜，增加了治疗难度，影响愈合效果。临床多见于压疮、糖尿病足溃疡、下肢动静脉溃疡等慢性伤口。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)俗称绿脓杆菌，是一系列严重化脓性感染，如支气管扩张、慢性支气管炎和囊状肺纤维化等基础疾病继发感染的重要致病菌，铜绿假单胞菌极易在体内外形成生物膜。该菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者极易感染本菌，常引发术后伤口感染，烧伤伤口也易感染铜绿色假单胞菌，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，引起的感染病灶可导致菌血症和败血症，可造成死亡。因此需要筛选抑制铜绿假单胞菌生长的药物或者方法，从而减少该菌的危害性。很多的研究已经证实PA对多种抗生素等杀菌药物产生了抗药性，如果能从天然植物提取物中发现对PA有杀灭效果的活性成分，并加以开发利用，将极大拓展防治该菌的药物谱。抗生素治疗细菌生物膜历来存在争议，有文献报道，抗生素虽然可杀灭链球菌，但却促进铜绿假单胞菌和沙雷菌等其他细菌形成生物膜，这些细菌定植于伤口的深层，抗生素难以发挥作用，导致细菌持续存在从而延缓伤口的愈合。疾病也能影响细菌生物膜生存与否，如糖尿病患者伤口中的链球菌是非糖尿病的63倍。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成的苦楝果提取物的制备方法，包括以下步骤：将苦楝果清洗后烘干至恒重，粉碎，得到苦楝果粉；往苦楝果粉中加入水，采用超声辅助水提法进行提取，得到提取液，将提取液离心，取上清液，将上清液浓缩，得到苦楝果提取物。优选，所述的制备方法，包括以下步骤：将苦楝果清洗后烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎至颗粒直径≤1mm，得到苦楝果粉；将苦楝果粉按100g/L的比例与蒸馏水混合，室温下超声提取30min，然后加热煮沸提取30min，再次超声提取30min，过滤，得到提取液；往滤渣中加入蒸馏水，煮沸提取30min，过滤，得到提取液，合并两次提取液，5000r/min离心10min，取上清液，将上清液减压抽滤，真空浓缩，灭菌，得到苦楝果提取物。上述制备方法中的超声提取的频率为40kHz，功率为100W。本专利技术的第二个目的是提供一种由上述的制备方法制备得到的苦楝果提取物。所述的苦楝果提取物的含量为0.25～1.0g/mL。本专利技术的第三个目的是提供由上述的制备方法制备得到的苦楝果提取物在抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成中的应用。本专利技术的苦楝果提取物可用于制备清洗压疮、糖尿病足溃疡、下肢动静脉溃疡、疥疮、头癣、湿疮、湿疹痛痒的药物、食品保鲜防腐剂或日化产品抗菌剂。本专利技术根据苦楝果中活性成分特性，配置特定的提取方法，提高了活性成分的提取率，提高苦楝果提取物对铜绿假单胞菌的生长及其生物膜形成的抑制效果。本专利技术的原材料源于植物，天然环保，抑菌效果显著，有益于人体健康，可应用于制备清洗伤口的药物、食品保鲜防腐剂或日化产品抗菌剂，应用范围和前景广阔。附图说明图1为苦楝果提取物对铜绿假单胞菌的抑菌效果。(A)为不同浓度的苦楝果提取物培养铜绿假单胞菌24h对细菌浮游菌的抑制效果(每个实验浓度8个平行，n＝8)，(B)为不同浓度的苦楝果提取物培养铜绿假单胞菌24h对细菌生物膜形成的抑制效果(每个实验浓度8个平行，n＝8)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。以下实施例中的测试菌株为铜绿假单胞菌(P.aeruginosaATCC9027)时，测试方法为：用该实施例中营养琼脂培养基(NA)斜面培养基将测试菌株于37℃培养1d，然后用PBS清洗，稀释到OD600＝1.0配制成菌悬液工作液，同时以无菌蒸馏水作为空白对照。按照梯度稀释的方法在培养体系中加入一定浓度的苦楝果提取物，吸取150μL到96孔细胞培养板中(每个实验浓度8个平行，n＝8)，然后将培养板放入37℃恒温培养箱静置培养24小时，最后将96孔板取出，用全波长酶标仪测定菌液的在600nm处的吸光度值(OD600)，与空白对照的吸光度值比较，以此评价苦楝果提取物对细菌浮游菌的抑制效果；然后，弃浮游菌并轻轻清洗板孔，晾干，在每个板孔内加入200μL1％(v/w)结晶紫染色液，静置染色30分钟，弃结晶紫染色液，再用无菌水洗板孔，室温晾干后，用200μL95％的乙醇脱色30min，利用全波长酶标仪测定其在595nm处的吸光度值(OD595)，与空白对照的吸光度值比较，以此评价苦楝果提取物对细菌生物膜形成的抑制效果。在本说明书中使用以下缩写：ATCC是美国模式培养物集存库(AmericanTypeCultureCollection)的简写，PA是铜绿假单胞菌，NA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成的苦楝果提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将苦楝果清洗后烘干至恒重，粉碎，得到苦楝果粉；往苦楝果粉中加入水，采用超声辅助水提法进行提取，得到提取液，将提取液离心，取上清液，将上清液浓缩，得到苦楝果提取物。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成的苦楝果提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将苦楝果清洗后烘干至恒重，粉碎，得到苦楝果粉；往苦楝果粉中加入水，采用超声辅助水提法进行提取，得到提取液，将提取液离心，取上清液，将上清液浓缩，得到苦楝果提取物。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将苦楝果清洗后烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎至颗粒直径≤1mm，得到苦楝果粉；将苦楝果粉按100g/L的比例与蒸馏水混合，室温下超声提取30min，然后加热煮沸提取30min，再次超声提取30min，过滤，得到提取液；往滤渣中加入蒸馏水，煮沸提取30min，过滤，得到提取液，合并两次提取液，5000r/min离心10min，取上清液，将上清液减压抽滤，...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭红，周刚，王颖思，施庆珊，谢小保，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44