编码鹿角车前草花粉主要过敏原-PLAL1的重组DNA及其应用制造技术

一个编码蛋白质或肽的核酸分子，该蛋白质或肽含有鹿角车前草（Ｐｌａｎｔａｇｏ　　ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）主要过敏原－Ｐｌａ　　ｌ　　１的至少一个抗原表位，其中核酸分子ａ）具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３的序列，ｂ）是ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３序列的一个片段，ｃ）含有一个编码ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：４的氨基酸序列或其片段的序列，ｄ）具有一个在严紧条件下与序列ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３杂交的序列，ｅ）具有通过ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３简并可衍生的一段序列，ｆ）序列ａ）－ｅ）中任一的互补链。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有鹿角车前草(Plantago lanceolata)主要过敏原Pla l 1的至少一个抗原表位的核酸分子。
技术介绍
近几年，I型过敏原影响着世界上成千上万的人，它在发达国家中的发病率有上升的趋势，导致了死亡人数上升和经济损失(1)。花粉过敏原是一些能够引起IgE介导的过敏性疾病的蛋白质或糖蛋白，这些疾病如花粉热和哮喘，大约有17％的人口在遗传上易患过敏性疾病。目前治疗这些疾病的方法主要体现在减轻症状。患者经常服用一些抗组胺类以及类固醇药物以减轻症状，然而这些药物并不能抑制IgE抗体的形成并经常会带来一些副作用。正如WHO Position Paper(2)所述，免疫治疗是唯一能够影响过敏性疾病的自然发生过程的治疗方法，而且它也有可能防止过敏性鼻粘膜炎患者患上哮喘病(2)。免疫治疗能够调节患者在给药(即施加大量适合的过敏反应提取物)过程中的免疫应答。但是，用于治疗的过敏反应提取物是从天然来源分离得到的蛋白质和非蛋白质成分的粗混合物，这些资源或者含有大量与过敏原无关的成分，或者几乎不含有造成患者高敏感性的过敏原。在最近几年，随着杂交瘤技术的发展，可以利用基于单克隆抗体的免疫试验对主要的过敏原含量进行鉴定，由此导致了在过敏反应提取物的标准化方面取得了重要进展(3)，所有对一种特定的过敏反应提取物敏感的患者都继续接受含全部提取物成分的相同的复杂混合物的治疗。但是这有可能导致副作用的产生，这个副作用主要由于对提取物中所有蛋白质成分(包括除主要过敏原PLA L 1外的其它过敏原)具有抗性的另外的IgE抗体所引起。就过敏诊断而言，这种使用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试的方法妨碍了导致患者敏感的特殊过敏原的检测。针对这些缺点，许多研究人员采用生物化学分离和纯化技术的方法分离得到单独的过敏原。然而，尽管这个方法对于过敏原的鉴定可能有效，但却不足以制备工业规模上的过敏原，因为这个过程极其耗费人力，并且从昂贵的自然资源中纯化出的过敏原产量通常情况下都很低。基于这些原因，用于合成过敏原蛋白质的重组DNA技术引起了人们的注意。利用可生长在大发酵罐中的微生物表达系统可以大规模获得重组过敏原。因此，这些技术使得重组过敏原以一致纯度大量生产。除此之外，使用rDNA技术可能表达抗原表位片段或修饰的过敏原以方便应用于过敏性疾病的诊断或处理。目前，很多研究人员都采用rDNA技术来研究过敏原，例如，最近一些来自螨类、草、树、土壤等的过敏原也都已经被克隆并表达了(4)。车前草属(Plantago)的植物花粉是空气过敏原的主要来源，并且可能是世界上许多国家花粉病的发生的部分原因。车前草属属于车前科(Plantaginaceae)，包括250个种。最常见的一个种就是鹿角车前草(英文名为plantain或ribwort)，主要分布在欧洲、澳大利亚以及北美洲的温带地区(5-8)。从本世纪初开始，鹿角车前草花粉就同花粉热联系在了一起(9-11)，而这些杂草则被认为是引起过敏性疾病的一种最重要的双子叶植物(12)。在过去的几年内，不同国家所开展的几项研究均显示出了这该物种的重要临床意义。受鹿角车前草过敏原影响最大的地区为澳大利亚(13)和地中海地区(14)。例如，Bousquet等人(15)在对患花粉热的患者检查时所发现的，其中36％的患者对蒙彼利埃(法国)的英国车前草(plantain)敏感。在英国，两项不同的研究均表明超过20％的季节性呼吸过敏患者对车前草呈现出皮肤阳性反应(16，17)。同样，在西班牙的不同城市也相继出现对这种花粉的过敏症状的流行(18-20)。然而，鹿角车前草在花粉病病原学上的真正作用还不清楚，因为只对车前草敏感的患者是罕见的。对车前草过敏的患者通常也会对在同一季节授粉的其它的植物过敏，尤其是草类花粉(17-21)。尽管上文中提到了一些报道，但是目前还没有表征车前草的主要过敏原的数据的报道，目前仅有的一些关于鹿角车前草过敏原鉴定方面的研究发表(17，21，22)。WO 98/59051公开了从橄榄树中获得的Ole e 1过敏原的克隆。众所周知，这个序列和来自于Pla l 1的一段8个氨基酸的序列同源。来自于桦树(疣皮桦Betula verrucosa)的一段序列在数据库中对应的登记号为Y14038。此序列编码的蛋白质同Ole e 1过敏原有着很高的同源性。鹿角车前草花粉的主要过敏原最近已经被鉴定、纯化并且其物理化学和免疫化学方面的特性(23)也已被部分表征了。Pla l 1是一种微不均一性的糖蛋白，其表观分子量在16-20KDa范围内。它的N端16个氨基酸残基已经被测得。在对车前草敏感的患者中，针对纯Pla l 1的特异性IgE流行程度为86％，它占IgE与车前草花粉提取物的总结合能力的大约80％。这个数据表明Pla l 1是鹿角车前草花粉中在临床上最相关的过敏原。专利技术概述本专利技术的目的是提供Pla l 1的核苷酸和氨基酸序列。本专利技术涉及编码包含鹿角车前草的主要过敏原-Pla l 1中至少一个抗原表位的蛋白质或肽段的核酸分子，其中此核酸分子a)具有序列SEQ ID NO3，b)是序列SEQ ID NO3的一个片段，c)含有编码SEQ ID NO4氨基酸序列或其部分的一段序列，d)具有一段在严紧条件下与SEQ ID NO3杂交的序列，e)具有通过SEQ ID NO3简并可衍生的一段序列，f)一条与a)-e)中任一序列互补的序列。采用分子克隆技术，分离编码Pla l 1过敏原的cDNA克隆并测定该克隆的核苷酸顺序，然后从上述核苷酸顺序中推导出氨基酸序列从而获得该蛋白质的完整化学结构。这个过程涉及到从鹿角车前草花粉中分离RNA并利用逆转录酶合成cDNA。利用PCR去特异性扩增编码Plal 1的cDNA，其特异性引物来源于天然过敏原的N末端序列。使用内部特异性引物对编码Pla l 1的cDNA进行5’端延伸能够测定编码Plal 1的信号肽和N末端的核苷酸序列。最后，使用对成熟蛋白的N末端和C末端专一的引物PCR扩增Pla l 1 cDNA，然后将编码Pla l 1的全长克隆插入到载体中，并在转化宿主细胞中表达该重组过敏原。花粉颗粒有一个坚硬的外壳，其内含有几个细胞，而蛋白质过敏原则存在于这些细胞内，因此，若要从花粉中分离mRNA，必须首先破碎其坚硬的外壳，然后再裂解细胞并从产生的混合物中提取mRNA。由于mRNA的不稳定性，通常其在活细胞中只存活几分钟，因此这种分离是很困难的。在本专利技术之前，曾经有人尝试分离鹿角车前草花粉Pla l 1的mRNA，但都没有成功。特别是，他们使用了大量不同的破碎花粉粒细胞壁、细胞裂解以及mRNA提取的方法，都没有成功。由本专利技术选择的方法组合分离得到了Pla l 1的mRNA。具体来说，使用一种改进的超声波处理步骤来破碎花粉粒细胞壁，同以前的超声波处理技术比较，本专利技术中的这个处理过程要延长许多。这种改进的超声波处理同含有硫氰酸胍的裂解缓冲液联合使用，并同基于苯酚-氯仿的提取试剂联合使用。本专利技术提供分离的编码鹿角车前草主要过敏原抗原表位的核酸分子，这种技术是过敏性疾病诊断和治疗上的一大进步，正如上面所述，它提供的方法克服了纯过敏原或其中对应于过敏原性部分的肽段的缺乏。尽管这种过本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码蛋白质或肽的核酸分子，该蛋白质或肽含有鹿角车前草主要过敏原－Ｐｌａｌ１的至少一个抗原表位，其中核酸分子：ａ）具有ＳＥＱＩＤＮＯ．：３的序列，ｂ）是ＳＥＱＩＤＮＯ．：３序列的一个片段，ｃ）具 有编码ＳＥＱＩＤＮＯ．：４的氨基酸序列或其片段的序列，ｄ）具有在严紧条件下与ＳＥＱＩＤＮＯ．：３序列杂交的序列，ｅ）具有由ＳＥＱＩＤＮＯ．：３简并可衍生的序列，或ｆ）序列ａ）－ｅ）中任一的互补 链。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：BC弗赖尔，AD佩拉莱斯，DB赫尔南德兹，GS杜兰，FP克拉莱斯，
申请(专利权)人：阿尔克阿贝洛有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]