抑制基因表达的方法技术

本发明专利技术涉及一种抑制靶基因表达的方法，包括用包含与至少部分靶基因的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的ＤＮＡ和ＲＮＡ的双链多核苷酸转染细胞、组织或单个的生物体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抑制靶基因表达的方法，通过用包含与靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的双链多核苷酸转染入细胞、组织或单个的生物体中进行的。
技术介绍
抑制细胞、组织或单个生物体中靶基因表达的方法，包括下面一种方法(以下有时称为RNAi方法)，其中将双链RNA转染入细胞、组织或单个生物体中，而加速了与其序列同源的mRNA的降解，结果抑制了作为该mRNA的模板的基因的表达(该效果以下有时称为“RNAi效果”)。至今，有报道表明在植物个体(Waterhouse，P.M等，Proc.Natl.Acad.Sci，95，13959-13964(1998))、锥虫(Ngo，H等，Proc.Natl.Acad.Sci，95，14687-14692(1998))、水螅(Lohmann J.U.等，Dev.Biol.，214，211-214(1999))、三肠虫(Sanchez Alvarado等，Proc.Natl.Acad.Sci，96，5049-5054(1999))、线虫(Fire，A等，Nature，391，806-811(1998))、果蝇(Kannerdell，J.R等，Cell，95，1017-1026(1998)；Misquitta，L等，Proc.Nat1.Acad.Sci，96，1451-1456(1999))利用该技术是有效的。此外，已有报道利用19个核苷酸的具有2-核苷酸的3`端突出的双链RNA可以在脊椎动物培养细胞中表现出RNAi效果，虽然该效果据报道仅限于脊椎动物(Elbashir，S等，Nature，411，494-498(2001))。下面要描述的在基因功能鉴定中，筛选适合于生产有用物质的细胞系的方法，利用RNAi方法的优越性是很明显地，但问题是RNA非常容易被核糖核酸酶所降解，尤其以单链形式存在时，因而生产成本非常高。因此，期望能够找到一种高度稳定的多核苷酸以用于RNAi方法。专利技术公开本专利技术目的之一是提供一种抑制靶基因表达的方法，其中靶基因与多核苷酸序列的部分核苷酸有基本相同的核苷酸序列，该方法通过将与DNA整合而被增强了稳定性的双链多核苷酸转染细胞、组织或单个生物体来实现的。为达到的上述目的而进行了广泛的研究，本专利技术发现，仓鼠培养细胞、CHO-KI，用具有荧光素酶基因的部分碱基序列的DNA和RNA杂交体的双链多核苷酸，和DNA和RNA嵌合体的双链多核苷酸进行转染后，细胞中的荧光素酶基因的表达被抑制。这样，我们成功的完成了本专利技术。也就是说，根据本专利技术，提供了下面第(1)到(24)项中描述的专利技术。(1)一种抑制靶基因表达的方法，其中包括用包含与靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的DNA和RNA的双链多核苷酸转染细胞、组织或单个的生物体。(2)根据上述第(1)项的方法，其中双链多核苷酸包含自我互补的单链。(3)根据上述第(1)或(2)项的方法，其中双链多核苷酸是DNA链和RNA链的杂交体。(4)根据上述第(3)项的方法，其中DNA链和RNA链的杂交体包含有义链DNA和反义链RNA。(5)根据上述第(1)或(2)项的方法，其中双链多核苷酸是DNA和RNA的嵌合体。(6)根据上述第(1)至(5)任一项的方法，其中在双链多核苷酸中，至少多核苷酸的上游部分区域是RNA。(7)根据上述第(6)项的方法，其中上游部分区域由9到13个核苷酸组成。(8)根据上述第(1)至(6)任一项的方法，其中双链多核苷酸由19至25个核苷酸组成，并且多核苷酸至少上游一半区域是RNA。(9)根据上述第(1)至(8)任一项的方法，其中靶基因有多个(plural)。(10)一种分析基因功能的方法，包括利用上述第(1)至(9)任一项所述方法而抑制了靶基因表达之后，分析细胞、组织或单个生物所显现的表型变化。(11)一种赋予细胞、组织或单个生物体以特定特性的方法，包括利用上述第(1)至(9)任一项所述方法以抑制靶基因的表达。(12)根据上述第(11)项的方法所得到的细胞、组织或单个生物体。(13)一种筛选用于预防和/或处理与靶基因相关疾病的试剂的方法，包括用待测物质加入到根据上述第(12)项的细胞、组织或单个生物体，并进而分析细胞、组织或单个生物体的特性改变。(14)一种用于预防和/或治疗与靶基因相关疾病的试剂，包含根据上述第(13)项的方法所获得的物质作为活性成分。(15)一种产生预防和/或治疗与靶基因相关疾病的试剂的方法，包括根据上述第(13)项的方法所选择出的物质制备药物制剂。(16)一种根据上述第(1)至(9)任一项的方法，进一步的包括用包含编码指示蛋白的DNA的表达载体转染细胞、组织或单个生物体，继而选择和分析具有指示蛋白所产生的信号量达到特定强度或更高的细胞、组织或单个生物体。(17)一种根据上述第(1)至(9)任一项的方法，进一步的包括用包含编码指示蛋白的DNA的表达载体和包含与DNA的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的双链RNA转染细胞、组织或单个生物体，继而选择和分析指示蛋白所产生的信号量减弱的细胞、组织或单个生物体。(18)根据上述第(16)或(17)项的方法，其中指示蛋白是如下特性蛋白其中蛋白的量与该蛋白所产生的信号的量之间成比例变化。(19)根据上述第(16)至(18)项任一项的方法，其中指示蛋白是荧光素酶。(20)RNAi方法中的一种鉴定RNA的功能域的方法，包括(i)制备具有与靶基因的至少部分核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的的双链多核苷酸，包括DNA和RNA嵌合体；(ii)用该双链多核苷酸转染细胞、组织或单个的生物体；(iii)在转染的细胞、组织或单个的生物体中测定靶基因的表达受到抑制的程度，和(iv)鉴定对于抑制靶基因而言是所需的RNA的序列。(21)根据上述第(20)项的方法，其中双链多核苷酸中的任一条链是RNA链。(22)在上述第(1)至(11)、(13)及(15)至(21)中任一项的方法中使用的双链多核苷酸。(23)一种制备预防和/或治疗与靶基因相关疾病的试剂，至少包括根据上述第(22)项的的双链多核苷酸。(24)一种用于实施上述第(1)至(11)、(13)及(15)至(21)任一项的方法的试剂盒，至少包括根据上述第(22)项的双链多核苷酸。附图简述附图说明图1表示用于制备双链多核苷酸的由21个核苷酸组成的有义单链多核苷酸和由21个核苷酸组成的反义单链多核苷酸。对于每一条序列，左端为5`末端，而右端为3`末端，粗体部分为RNA，有下划线的为DNA。图2表示的是用DNA-RNA杂交体双链多核苷酸转染CHO-KI细胞而抑制luc基因的表达。图3表示luc基因的表达受抑制的图，其是在每一条有义链均为RNA而每一条反义链均是DNA-RNA嵌合体所组成的双链多核苷酸转染S2细胞情况下。图4表示luc基因的表达受抑制的图，其中每一条反义链均为RNA而每一条有义链均是DNA-RNA嵌合体所组成的双链多核苷酸转染Hela细胞和HEK293细胞。图5表示luc基因的表达受抑制的图，其中DNA-RNA嵌合体的双链多核苷酸转染CHO-K1细胞。本专利技术的最佳实施方式下面对本专利技术进行更详细的描述。(1)用于RNAi方法的包含DNA和]RNA的双链多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制靶基因表达的方法，其包括用双链多核苷酸转染细胞、组织或单个的生物体，该双链多核苷酸包含具有至少与靶基因的部分核苷酸序列基本上相同的多核苷酸序列的ＤＮＡ和ＲＮＡ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：程久美子，梶隆英，上田龙，西乡薰，
申请(专利权)人：三菱化学株式会社，西乡薰，
类型：发明
国别省市：JP[日本]