提供了激活目的基因的组合物和方法。该组合物含有一个只有存在靶分子时才表达基因产物的隐藏靶向表达盒。表达盒可用于治疗疾病和防止致瘤细胞增殖。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
激活目的基因的组合物和方法 相关申请本申请要求1997年6月25日提交的美国临时申请号60/050,772的优先权。 本专利技术的领域本专利技术涉及特别是在靶基因存在下激活目的基因的方法和组合物。 本专利技术的背景癌症治疗的本质和基本方法一直是变化的。目前，局部癌症治疗后常规是辅助性化疗。现在的临床方案中正在探索基因疗法，免疫系统操纵，正常造血因子的激活，在肿瘤组织中诱导分化，以及血管形成的抑制。这些新领域的研究已经用于非恶性疾病。同时，新的临床方案有狭窄的治疗指数并且有很大可能导致有害的副作用。完整的理解药理学，药物相互作用，及临床药物动力学对于安全和有效的用于人体是必需的。病毒感染的治疗正处于萌芽阶段。典型的使用药物诸如利用了感染的生物体与其宿主代谢的差别的抗生素来治疗细菌感染。然而，病毒大部分使用宿主自身的酶完成复制，从而很少有机会进行药物干涉。通过使用强调节元件，病毒利用宿主基因实现其自身基因的转录和翻译。在哺乳动物中，天然的由细胞毒性T-淋巴细胞对抗病毒感染，它在宿主细胞表面表达时识别病毒蛋白质，并裂解感染的细胞。破坏感染的细胞阻止了病毒的进一步复制。其它的防御包括表达抑制蛋白质合成和病毒芽殖的干扰素，以及表达从体液中清除游离病毒颗粒的抗体。但是，这些天然机制的诱导需要将病毒蛋白质暴露于免疫系统。许多病毒显示休眠或潜伏期，在此时期很少或不进行蛋白质合成。在这种时期对免疫系统而言病毒感染实际上是不可见的。逆转录病毒具有RNA链的基因组感染形式。感染时，RNA基因组反转成DNA，典型地随后在随机位点整合到宿主染色体DNA。当整合发生在截短的编码关键的细胞受体或生长因子的位点，或将这类基因置于强病毒顺式-->作用调节元件的控制下，将导致细胞转化成恶性状态。由于它们的反式作用调节元件对宿主调节序列的作用，病毒可能是致癌的。事实上，致癌性是导致发现第一个已知感染人体的逆转录病毒的特征。在感染成人T-细胞白血病(ATL)病人的血细胞中鉴定了HTLV-I和HTLV-II(人嗜T-淋巴细胞病毒I和II)，相信通过它们的反式激活因子对淋巴细胞启动子区域的作用诱导致瘤性转化。亦发现另外两种逆转录病毒感染人体。这些病毒，HIV-I和HIV-II，是爱滋病的病原体。现在对HIV感染的治疗方法包括叫作蛋白酶抑制剂的新药物。当与其它抗病毒复合物诸如AZT一起使用时，这些药物能显著降低血液中HIV水平。同时，在免疫系统防御多肽分子中叫作趋化因子的天然武器显示出是HIV的颈敌。反义寡聚脱氧核苷酸已经推荐为重要的一类新药物。简言之，反义是指使用类似单链DNA的小的合成的寡核苷酸抑制基因表达。基因表达是依据Watson-Crick碱基配对即腺嘌呤和胸腺嘧啶或者鸟嘌呤与胞嘧啶通过氢键相互作用通过与特定靶信使RNA(mRNA)中编码(有义)序列的杂交实现抑制的。依据控制反义寡聚脱氧核苷酸和细胞RNA相互作用的简单碱基配对法则，可以设计靶向任何已知序列基因的分子。这种策略的主要优势在于作用的潜在特异性。理论上，可以设计靶向整个人类基因组中任何单个基因的反义分子，可能制造出已知致病基因的任何疾病的专一性药物。结果是，存在多种反义寡聚脱氧核苷酸(ODN)活性的应用物用于可能的抗病毒和抗癌应用。反义ODN提供了阻碍细胞中特定基因表达的可能性。虽然有许多在培养细胞中明显反义抑制基因表达的报道，但只在很少的情况下严格证明了专一性抑制。在许多研究中，专一性是从反义的生物学作用与对照ODN的比较推导的，没有测定靶RNA或蛋白质的水平来评价专一性。反义技术不想要的副反应可能通过多种机制发生。目前正在认真研究寡聚核苷酸作为基因表达调节子的可能性。多数的努力集中于抑制诸如癌基因或病毒基因等靶基因的表达。寡聚核苷酸靶向RNA(反义寡核苷酸)或DNA，形成三链结构抑制RNA聚合酶II的转录。为了达到所需的作用，寡核苷酸必须通过有效防止其从头合成来促进先存的不-->需要的蛋白质的衰变。因而需要开发比以前研究所用方法更有效，可靠和特异的新反义方法。 本专利技术的总结提供了激活目的基因表达的组合物和方法。组合物是含有双链核苷酸序列的反义隐藏表达盒。第一条链含有一段伸出臂的(armed)表达盒，即连接在侧翼序列下游的编码目的蛋白质的RNA分子并且在RNA序列上游可操作的插入翻译起始点。侧翼序列编码靶分子。也就是说，侧翼序列编码靶基因或编码感兴趣的RNA。侧翼序列对应于靶的“有义”链。同时提供了能与第一条核苷酸序列的侧翼序列杂交的第二条核苷酸链，即反义链。结合时反义链掩盖了翻译起始点。可设计侧翼序列使反义序列与侧翼序列没有100％同源性。这样，存在靶核苷酸分子时，反义链倾向于与靶互补结合。此时，反义链从伸出臂的链解离并与靶配对。反义链的解离暴露出核糖体结合位点使伸出臂的盒在靶的存在下翻译。发现该组合物可用于调节基因表达，治疗疾病，以及阻止致瘤细胞的增殖。另外，该组合物在植物和动物学应用中也可广泛使用。 附图的简要说明图1提供了作为抗病毒药物的掩藏靶向表达盒的示意图。图2提供了有义链靶序列与反义链完全互补的掩藏靶向表达盒的示意图。图3提供了具有用于增加靶特异性的多联体几何结构的掩藏表达盒的示意图。图4提供了具有需要定量阈值的靶分子以起始所需基因翻译的多联体几何结构的掩藏靶向表达盒的示意图。图5提供了增加紧凑度和降低粘度的环状掩藏靶向表达盒的示意图。图6提供了增加紧凑度的茎环掩藏靶向表达系统的示意图。图7提供了产生靶向盒有义链的构建体实施例。图8提供了使用掩藏靶向表达盒的体外实验的示意图。 本专利技术的详细描述后面将参照优选实施方案更完整的描述本专利技术。本专利技术可通过不同形式实施而不应认为限于此处叙述的实施方案；更确切地，提供的实施方案是使本公开物将本专利技术的范围传递给本
熟练人员。-->提供了控制目的基因表达的组合物和方法。通过使用与靶分子反义的寡核苷酸调节表达。此方式下，目的基因只在对应于靶分子的RNA或DNA存在时表达。该方法涉及使用一种反义掩藏表达盒。反义掩藏表达盒设计为双链核酸分子。第一条链含有连接到侧翼序列下游的目的蛋白质的RNA分子。侧翼序列含有一段靶基因部分有义序列的核苷酸序列。第一条链还在侧翼序列下游含有一个翻译起始点。需要认识到插入核糖体结合位点的部位可以是变化的。可选地，可包括7个甲基鸟嘌呤帽子以稳定分子。参看图1。掩藏表达盒的第二条链含有对应于靶基因或序列的反义寡核苷酸。也就是说，反义序列至少部分与侧翼序列包含的靶序列互补。反义寡核苷酸可以是RNA分子，DNA分子或其混合物。第二条反义链与第一条链的相应侧翼序列结合形成的双链体排斥了对下游序列包括翻译起始点，目的序列或两者都有的核糖体扫描。因而，通过反义链与侧翼序列的结合掩藏了目的蛋白质的翻译和表达。从侧翼序列置换反义链中断对目的蛋白质表达和翻译的掩藏。目的蛋白质可依据组合物的用途变化。例如，当掩藏盒示意图作为抑制致瘤细胞生长的机制时，目的蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
含有双链核酸分子的掩藏表达盒，其中第一条链含有连接到侧翼序列下游的编码目的蛋白的ＲＮＡ序列，并且有一个可操作的插入ＲＮＡ序列的上游的翻译起始点；以及，结合到侧翼序列的第二条反义链，其中上述第二条链对应靶分子的反义寡核苷酸。
【技术特征摘要】
US 1997-6-25 60/050,7721.含有双链核酸分子的掩藏表达盒，其中第一条链含有连接到侧翼序列下游的编码目的蛋白的RNA序列，并且有一个可操作的插入RNA序列的上游的翻译起始点；以及，结合到侧翼序列的第二条反义链，其中上述第二条链对应靶分子的反义寡核苷酸。2.权利要求1的盒，其中上述盒进一步含有连接到侧翼序列5′末端的7-甲基鸟嘌呤帽子。3.权利要求1的盒，其中上述目的蛋白编码一种毒素。4.权利要求1的盒，其中上述靶含有为致瘤细胞独有的寡核苷酸。5.抑制致瘤细胞生长的一种方法，包括将上述细胞与含有双链核酸分子的掩藏表达盒接触；其中第一条链含有连接到侧翼序列下游的编码目的蛋白质的RNA序列，以及可操作的插入到该RNA序列上游的翻译起始点；以及结合到侧翼序列的第二条反义链，其中上述第二条链对应于靶分子的反义寡核苷酸。6.权利要求5的方法，其中上述盒进一步含有连接到侧翼序列5′末端的7-甲基鸟嘌呤帽子。7.权利要求5的方法，其中上述翻译起始点含有Kozak序列。8.权利要求5的方法，其中上述目的蛋白质是一种毒素...
【专利技术属性】
技术研发人员：小查尔斯A布莱克，
申请(专利权)人：小查尔斯A布莱克，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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