青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因和在制药中的应用制造技术

本发明专利技术涉及青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin‑SN61及其编码基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin‑SN61是一种直链多肽，含有12个氨基酸残基，分子量为1210.22道尔顿，等电点7.4，其基因序列如SEQ ID NO:1所示，多肽全序列一级结构如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的Hydrostatin‑SN61能够明显抑制TNF‑α引起的炎症反应，可以作为制备如结肠炎、类风湿性关节炎等多种复杂炎症疾病或自身免疫性疾病的治疗药物被应用。青环海蛇活性肽Hydrostatin‑SN61具有分子量小、结构简单、人工合成方便、抗炎活性强的特点。

【技术实现步骤摘要】
青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因和在制药中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因和在制药中的应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF-α)是参与全身性炎症反应的细胞信号传导蛋白，也是构成急性期反应的细胞因子之一。它主要由活化的巨噬细胞产生，还可以由许多其他细胞类型产生，如CD4+淋巴细胞，NK细胞，中性粒细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞和神经元细胞。作为一种多效的细胞因子，TNF-α是生物学过程中的关键性调控因子之一，在细胞再生、迁移、炎症和凋亡过程(程序性细胞死亡)等方面都具有作用。TNF-α是许多自身免疫性疾病的炎症介质，例如类风湿性关节炎，炎症性肠病(IBD)和多发性硬化症等。有证据表明，IBD患者的肠粘膜，粪便和血液样本中的TNF-α水平升高，且TNF-α的水平与克罗恩病患者的临床疾病活动性相关(参见文献：B.Ngo,C.P.Farrell,M.Barretal.“Tumornecrosisfactorblockadefortreatmentofinflammatoryboweldisease:efficacyandsafety”.CurrentMolecularPharmacology,vol.3,no.3,pp.145–152,2010.)。TNF-α单抗类生物制剂的出现使IBD、类风湿性关节炎等复杂炎症疾病或自身免疫性疾病的治疗方法出现了根本改变。在短期和长期用药过程中，抗TNF治疗均显示出了减轻疾病症状，治愈肠粘膜溃疡，减少住院和手术以及减少糖皮质激素的使用等功效。但并不是所有患者对其治疗反应均相同，高达40％的患者无反应，甚至出现一定的不良反应如感染等，这可能是因为不加区别地阻断细胞因子活性，从而导致宿主抗感染能力下降所致。TNF-α是通过与细胞膜上的相应受体TNFR结合发挥多种生物学功能，TNFR包括TNFR1和TNFR2两种受体，TNF-α主要通过TNFR1传递促炎、凋亡信号，促使机体产生炎症或免疫反应，而TNFR2的主要功能是参与机体增殖与再生。随着对疾病发病机制的深入研究，当前更多的研究是把治疗的靶点转向TNFR。总体上从抗炎角度来说，现在该类药物的研发热点在于通过阻断TNFR1传递的信号通路来封闭TNF-α的生物学功能。IL-10是一种免疫调节性细胞因子，由不同类型的细胞产生，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和肥大细胞。IL-10同时能抑制T淋巴细胞、单核细胞的功能以及巨噬细胞的活化和效应作用，是一个对大多数造血细胞都有不同影响的细胞因子，其最主要的功能是限制和最终终止炎症反应。目前的研究发现，IL-10参与了IBD的发病过程。IL-10基因缺陷小鼠可自发产生结肠炎(参见文献：KühnR,J,RennickD,RajewskyK,MüllerW.Interleukin-10-deficientmicedevelopchronicenterocolitis.Cell1993；75:263-274.)。利用IL-10基因敲除小鼠自发性结肠炎疾病模型已被用于研究IBD的发病机制与治疗药物开发。青环海蛇(Hydrophiscyanocinctus)是记载于《本草纲目》中一种海洋来源的中药，其活性成分主要为蛋白质和多肽，具有抗炎、抗肿瘤、抗血栓、镇痛、降压等功效。中国专利CN103030687A已公开了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1，含有二十二个氨基酸残基，分子量为2483.68道尔顿，等电点4.39，其基因序列为：5’-GACGAACAACACCTAGAGACCGAACTACACACTCTCACCAGCGTGCTGACAGCCAATGGATTCCAA-3’，多肽全序列一级结构为：Asp-Glu-Gln-His-Leu-Glu-Thr-Glu-Leu-His-Thr-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Thr-Ala-Asn-Gly-Phe-Gln，与TNFR1的结合能力强于与TNFR2、TNF-α的结合能力，具有抗炎活性。但目前尚无文献报道有关青环海蛇的生物活性肽Hydrostatin-SN61的报道。
技术实现思路
本专利技术以TNFR1为靶点淘选青环海蛇毒腺噬菌体展示文库筛选获得一种新的抗炎活性肽Hydrostatin-SN61。对其进行深入研究，发现该抗炎活性肽能够有效抑制TNFR1介导的生物活性，具有极大的药用前景。本专利技术第一方面，提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因和在制药中的应用。本专利技术第一方面，提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61，所述的青环海蛇抗炎活性肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。所述青环海蛇抗炎活性肽是一种直链多肽，含有十二个氨基酸残基，分子量为1210.22道尔顿，等电点7.4。本专利技术还提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61的编码基因，该编码基因为如SEQIDNO:1所示的DNA分子。本专利技术第二方面，提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61的筛选方法，该方法包括如下步骤：(1)生物淘选：以人重组肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(TNFR1)作为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库，用1×PBS将人重组TNFR1稀释至浓度为1μg/ml，以1μl蛋白+99μl碳酸盐缓冲液(CBS)包被96孔ELISA板；3h后用TBST洗涤3次，封闭液封闭过夜。包被好的ELISA板，每孔加入200μl噬菌体，37℃孵育3小时；以TBST溶液洗板4次，加洗脱液于37℃孵育20分钟，从ELISA板上将结合的噬菌体洗脱下来，以宿主菌BLT5403(Novagencompany)扩增洗脱下的噬菌体，完成第一轮淘选。按上述方法继续进行两次生物淘选，筛选获得多个噬菌体克隆(包含不同的插入片段，即不同的目的基因片段)。以引物up(SEQIDNO:3)和down(SEQIDNO:4)PCR扩增第三轮淘选所得噬菌体，其中一条插入片段(目的基因)经测序鉴定序列为：5’-TCGGATCCCCGAGCATCACACCTGACTGGAATACGA-3’(如SEQIDNO:1所示)，即SN61基因序列；其氨基酸序列一级结构为：Ser-Asp-Pro-Gly-Ala-Ser-His-Leu-Thr-Gly-IIe-Arg(SDPGASHLTGIR)，如SEQIDNO:2所示；(2)合成：以固相多肽合成技术合成Hydrostatin-SN61，并以HPLC及MS分析其纯度和分子量，其分子量为1210.22道尔顿，等电点7.4。本专利技术的第三方面，提供了青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因在制药中的应用，所述应用为制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的应用。其中，所述与TNF-α相关的疾病，包括结肠炎、类风湿性关节炎等多种复杂炎症疾病或自身免疫性疾病的药物中的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于，所述的青环海蛇抗炎活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于，所述的青环海蛇抗炎活性肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于：所述青环海蛇抗炎活性肽是一种直链多肽，含有十二个氨基酸残基，分子量为1210.22道尔顿，等电点7.4。


3.一种如权利要求1或2所述的青环海蛇抗炎活性肽的编码基因，其特征在于，该编码基因为如SEQIDNO:1所示的DNA分子。


4.一种如权利要求1或2所述的青环海蛇抗炎活性肽的筛选方法，该方法包括如下步骤：
(1)生物淘选：以人重组肿瘤坏死因子Ⅰ型受体TNFR1作为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库，用1×PBS将人重组TNFR1稀释至浓度为1μg/ml，以1μl蛋白+99μl碳酸盐缓冲液CBS包被96孔ELISA板；3h后用TBST洗涤3次，封闭液封闭过夜；包被好的ELISA板，每孔加入200μl噬菌体，37℃孵育3小时；TBST洗板4次，加洗脱液于37℃孵育20分钟，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆一鸣，郭姗姗，荣旭丽，王庭芳，熊礼燕，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31