抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术是由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体Ｂ和Ｃ。该两株杂交瘤细胞的保藏号：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４１９和ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４２０，与该两单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于淋巴囊肿病毒的囊膜上；常规培养２－３天的杂交瘤细胞培养液含有大量该单抗Ｂ和Ｃ；该单抗Ｂ和Ｃ的金标记免疫电镜鉴定显示：在该病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征在该病毒囊膜上存在单抗Ｂ和Ｃ的抗原决定簇，其更显其优越性和先进性。该两单抗Ｂ和Ｃ将为建立该病毒的单抗诊断技术，将为在分子水平上定位该病毒的靶器官，将为研究该病毒感染动态及增殖，将为搞清该病毒传播、流行病学规律，奠定坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体应用技术的改进，具体讲是一种由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)单克隆抗体及其制备方法，属于分子免疫学和病毒学交叉

技术介绍
淋巴囊肿病是一种慢性病毒病，患病鱼的表皮、鳍和尾部等处出现许多囊肿。淋巴囊肿病的病原为淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)。淋巴囊肿病流行地区较广，呈世界性分布，目前已知至少42科125种以上的鱼可被淋巴囊肿病毒感染。近年来，日本以及我国广东、福建、浙江、山东、河北等省养殖的鲈鱼、石斑鱼、真鲷、大菱鲆和美国红鱼等均发生过此病，此病全年可见，但在水温10-20℃为发病高峰期。发病初期病鱼运动、摄食尚正常，但生长缓慢；病情严重的基本不摄食，部分死亡；网箱和室内水泥池工厂化养殖牙鲆的感染率可高达90％以上。国内外检测鱼类病毒的方法大致归为四类组织病理学检测技术、细胞培养技术、免疫学检测技术、分子生物学检测技术。应用免疫学检测技术的关键在于制备高质量的抗血清，由于常规方法制备的抗血清为多克隆抗体，具有某些交叉反应，因而限制了病毒种型的特异性鉴定。近年来利用单克隆抗体技术，提高了免疫学检测技术的权威性和特异性，使鱼类病毒的诊断与鉴定更加可靠。但至今尚无牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体研制的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是填补有关鱼类淋巴囊肿病毒单克隆抗体研究的空白，提供一种由杂交瘤细胞分泌的。本专利技术拟以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体。本专利技术的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体。该两株杂交瘤细胞的保藏单位CCTCC，地址中国武汉大学内，保藏日期2004/12/14，保藏号CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，该两培养物名称分别为小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E1和LCDV-E2；与该两株杂交瘤细胞分泌的特异性抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体(简称淋巴囊肿病毒单抗B和C)发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；该淋巴囊肿病毒单抗B和C的金标记免疫电镜鉴定结果显示在牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征与该淋巴囊肿病毒单抗B和C发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；在倒置显微镜下观察，生长状态良好的杂交瘤细胞外观饱满、浑圆、折光性强、细胞形态均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。一种由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法，该制备方法是以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，经免疫balb/c小白鼠，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体；再选择免疫学的检测鉴定方法，筛选鉴定出淋巴囊肿病毒单抗B和C。所述的选择免疫学的检测鉴定方法之一，是采用间接免疫荧光抗体法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C。所述的选择免疫学的检测鉴定方法之二，是采用斑点免疫印迹法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C。所述的选择免疫学的检测鉴定方法之三，是采用金标记免疫电镜法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C，并确定其抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上。一种由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，即淋巴囊肿病毒单抗B和C作为在进行鱼类淋巴囊肿病毒流行病学调查过程中的应用。所述的鱼类淋巴囊肿病毒流行病学调查的鱼类有许氏平鲉；真鲷；花鲈；云纹石斑鱼。所述的淋巴囊肿病毒单抗B和C作为在进行淋巴囊肿病毒的靶器官调查过程中的应用。所述的调查的组织或器官有牙鲆的肠道组织，和/或表皮组织，和/或鳃组织，和/或胃组织。本专利技术的优点在于由于一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，该两株杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，与该两株杂交瘤细胞分泌的特异性抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；该淋巴囊肿病毒单抗B和C的金标记免疫电镜鉴定结果显示在牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征与该淋巴囊肿病毒单抗B和C发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上，所以使得本专利技术的淋巴囊肿病毒单抗B和C产品真实存在，并有应用价值。杂交瘤细胞在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该细胞外观饱满、浑圆、折光性强、细胞形态均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗淋巴囊肿病毒单抗。由于本专利技术采用了免疫荧光抗体方法和斑点免疫印迹方法，所以使得确认该淋巴囊肿病毒单抗与淋巴囊肿病毒发生的特异性结合反应真实存在。本专利技术尤其重要的是采用了金标记免疫电镜方法，将免疫标记技术与电镜技术结合起来，使之兼有两技术的优点，因此能够更加进一步直观地显示该淋巴囊肿病毒单抗与淋巴囊肿病毒发生的特异性结合反应在牙鲆淋巴囊肿病毒粒子的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即证实与该淋巴囊肿病毒单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于淋巴囊肿病毒的囊膜上。本专利技术的金标记免疫电镜结果直接显示出淋巴囊肿病毒单抗的抗原决定簇位于该病毒的囊膜上的这一成果，为建立淋巴囊肿病毒病的单克隆抗体诊断方法，为从分子水平上定位该病毒的靶器官，为研究该病毒感染动态及增殖特点、流行病学规律等奠定了坚实的基础。另外，该单抗的成功制备不仅为该病毒亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等的研制提供了理论依据和实践指导，而且可为不同地域、不同宿主病毒的区分和研究病毒的保护性抗原提供手段和方法。由于本专利技术所述的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法是以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，经免疫balb/c小白鼠，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体；再经过免疫学检测鉴定技术筛选出淋巴囊肿病毒单抗。这样的制备技术路线充分发挥了现有免疫学技术的检测鉴定方法的作用和效果，尤其是金标记免疫电镜结果直接显示出淋巴囊肿病毒单抗的抗原决定簇位于该病毒的囊膜上，更显其优越性和先进性。附图及其具体实施方式本专利技术的实施例结合附图进一步说明如下图1为本专利技术的淋巴囊肿病毒单抗制备方法的工艺流程方框图。图2为本专利技术的淋巴囊肿病毒单抗与病毒反应机理。图3为采用免疫电镜方法鉴定结果图。图4为采用免疫电镜方法鉴定结果图。图5为采用间接免疫荧光抗体方法鉴定结果图。图6为采用间接免疫荧光抗体方法鉴定结果图。图7为采用免疫斑点印迹方法鉴定结果图。图8间接免疫荧光抗体方法检测许氏平鲉囊肿细胞结果图。本专利技术的附图说明参见图1-8图1表示本专利技术的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法的工艺流程是以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体；再经免疫学的检测鉴定方法筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗。图2中有1表示标记的羊抗小鼠IgG抗体(标记物分别为金粒子、酶、荧光素等)；2表示该淋巴囊肿病毒单抗；3表示淋巴囊肿病毒粒子。图3显示在牙鲆淋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，其特征在于：该两株杂交瘤细胞的保藏号：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４１９和ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４２０，与该两株杂交瘤细胞分泌的特异性抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体（简称：淋巴囊肿病毒单抗Ｂ和Ｃ）发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；该淋巴囊肿病毒单抗Ｂ和Ｃ的金标记免疫电镜鉴定结果显示：在牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征与该淋巴囊肿病毒单抗Ｂ和Ｃ发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；在倒置显微镜下观察，生长状态良好的杂交瘤细胞外观饱满、浑圆、折光性强、细胞形态均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养２－３天，培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：战文斌，程顺峰，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]