一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株，其特征在于牙鲆淋巴囊肿病毒毒株Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ ｌｙｍｐｈｏｃｈｓｉｔｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＬＣＤＶ↓［０１１１２６］，ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０２００７。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及淡、海水鱼类疾病病原及分离、扩增与鉴定技术，特别涉及海洋养殖鱼类虹彩病毒的体外增殖、检测诊断技术及其材料来源，更具体涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株，同时，还涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株的制备方法和在鱼类淋巴囊肿病毒检测与诊断及在海水鱼虹彩病毒在细胞工程疫苗制备中的用途。
技术介绍
牙鲆(Paralichthys olivaceus，Japanese flounder)是深受消费者欢迎、市场前景非常看好的海水养殖经济鱼类。但随着海水养殖业集约化和快速发展，由淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)引起的牙鲆淋巴囊肿病呈急剧蔓延的态势。在患有这种病的鱼体表、头、躯干、吻、尾鳍的皮肤上，有白色水泡和囊状物形成，淋巴细胞大量聚积而成，呈肿瘤状，病情严重的鱼，在腮乃至肠道中也会出现散在或成群的囊肿。病鱼摄食不便，生长缓慢，使原本名贵的牙鲆丧失其经济和食用价值。病毒性淋巴囊肿是一种常见于鱼类皮肤和鳍上出现肿瘤样病变的疾病，淡、海水鱼类均可发生。因与患病鱼接触，或当病鱼囊肿破溃时，病毒逸出水中而使正常鱼感染发病。LCDV是虹彩病毒的成员，由虹彩病毒引起的爬行动物、两栖动物和鱼类疾病已在美洲、欧洲、亚洲和澳洲等地普遍流行。淋巴囊肿病毒呈球形，其直径大小为200±50nm。19世纪开始，人们就已知淋巴囊肿病毒在世界各地流行，对淡、海水鱼造成危害。多年来，对淋巴囊肿病的病原学、病理学、流行病学等方面进行了研究，国内也有相关报道。近年，又对该病的病原LCDV进行了分子生物学、快速检测、病原分离纯化等研究，并取得了明显的进展。但该病毒的体外扩增尚未有突破。尽管关于鱼类淋巴囊肿病毒的分离培养始于20世纪60年代，历时约40年，但这种病毒株的体外培养十分困难，仅观察到LCDV可在少数海水鱼细胞中引起病变，而且所需时间较长，多数在一周以上。迄今国内外尚未建立牙鲆淋巴囊肿病毒经济实用的生物学检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在提供一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株，通过LCDV011126的体外扩增，建立LCDV复制与感染系统，解决了LCDV在淡水鱼细胞系中增殖的技术问题。本专利技术的另一个目的在于提供一种制备牙鲆淋巴囊肿病毒毒株的方法，该方法过程简单，易于人工调节和控制，成本低。本专利技术还涉及一种准确有效的牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在鱼类淋巴囊肿病毒检测和诊断中的应用。本专利技术还涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在生物学在鉴定鱼类淋巴囊肿病毒中的应用。本专利技术还涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在细胞工程疫苗制备中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案将被牙鲆淋巴囊肿病毒株(LCDV011126)侵染鱼的病变组织(如皮肤表面的肿瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍体积的磷酸缓冲液(PBS)进行匀浆，再加入双抗，置冰箱-20℃冰冻过夜，次日取出待其融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获LCDV011126病毒粗提液。将制备好的LCDV011126病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的草鱼肾CO011126细胞(上皮样)和CIK011126细胞(成纤维样)等十多种不同的淡、海水鱼类细胞中。同时设有相应的正常细胞对照，并置温度为20℃的恒温培养箱中继续培养。利用光学显微镜，定时观察已接种了LCDV011126病毒粗提液的细胞变化情况，并与相应的正常细胞作比较。连续传代3次，每次都持续观察2周以上。在接种了LCDV011126病毒粗提液的这些淡、海水鱼类细胞中，多数种类的细胞单层未出现病理变化，这些细胞是LCDV011126病毒不敏感的细胞。通过光镜可观察到在接种了LCDV011126病毒并继续培养了24-36小时的CO011126细胞和CIK011126细胞单层细胞上出现补疤样病变，病变斑中局部有细胞量增多、堆积，类似烧、烫伤的皮肤表面，凸凹不平。这不同于其它多数水生动物病毒引起的细胞产生裂解、出现脱落，并在单层细胞中形成大小不同的空洞(空斑)样病变。接种了LCDV011126病毒粗提液的CO011126细胞和CIK011126细胞出现了特有的病变斑——补疤样病变，故被确定为对LCDV011126敏感的细胞。牙鲆淋巴囊肿病毒毒株LCDV011126(Paralichthys olivaceus lymphochsitis disease virus，LCDV011126)，通过电镜观察可见，在病变细胞中有LCDV011126颗粒，呈球形，直径大小130-260nm。宿主细胞也出现了产生空泡、肿胀膨大、细胞器破坏等超微病变。LCDV011126已交中国典型培养物保藏中心(武汉)，保藏号为CCTCC-V202007。本专利技术提供的牙鲆淋巴囊肿病毒体外增殖系统和方法能有效进行LCDV的生物学检测与诊断，通过LCDV011126的体外扩增，建立LCDV复制与感染机理研究的体外模型。同时由于体外扩增条件易于人工调节和控制、且经济、省时，制备材料均一。因为并非通过感染鱼体来收集病料，可在不污染水体和环境的前提下，就可提供淋巴囊肿病毒疫苗研制及生产所需的原料。已知LCDV的生物学鉴定方法是通过鱼体回接感染或海水鱼细胞接种，这两种生物学鉴定LCDV的方法与本专利技术比较，前者成本较高，后者时间较长。由于感染了病毒的鱼组织匀浆液中含有LCDV011126，接种到CO011126细胞和CIK011126细胞上，在2-3天内，会引起细胞产生特有的病变斑——补疤样病变，因此本专利技术可运用于LCDV的检测和诊断。通过培养细胞扩增病毒的条件易于人工控制、不会受到来自宿主动物机体免疫作用的干扰。扩增出的病毒会直接用于细胞工程疫苗的生产，或通过基因工程的方法，制备病毒核酸疫苗。其步骤如下A、以患有淋巴囊肿病的牙鲆肿瘤组织作为材料；B、将病鱼组织(如皮肤表面的肿瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍体积的PBS进行匀浆，加入双抗后，置冰箱-20℃冰冻过夜，次日取出待其融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获LCDV011126病毒粗提液。将制备好的LCDV011126病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的草鱼肾CO011126细胞和CIK011126细胞中，同时设有相应的正常细胞对照，并置温度为20℃的恒温培养箱中继续培养。利用光学显微镜，定时观察已接种了LCDV011126的细胞，并与相应的正常细胞作比较。C、对接种细胞活体或染色后，进行显微观察，证实LCDV011126在2-3天内可引起CO011126病变(图1)和CIK011126细胞病变(图2)。D、将接种病毒后24小时收集的细胞样品，经固定、超薄切片和染色后进行超微观察，明确病毒引起感染细胞的体积明显膨大，超过未感染细胞的5倍-15倍(图3)。据最近对本实验室分离到的牙鲆淋巴囊肿病毒LCDV011126株基因组的序列分析显示，该病毒基因组全长为186.25kb，比目前已知的其它3株水生动物虹彩病毒基因组要大70kb左右，是已知脊椎动物虹彩病毒基因组最大的一个，共有240个开放阅读框，其中与已知淋巴囊肿病毒标准株LCDV-1有同源性的基因超过百个，其中病毒的主要衣壳蛋白基因有较高的同源性。可知，能引起100多种淡海水鱼类出现淋巴囊肿病的病毒病原，虽有不同的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张奇亚，李正秋，袁秀平，桂建平，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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