一种抗人免疫缺陷病毒Ｉ型（ＨＩＶ－１）ｐ２４蛋白的单克隆抗体及其应用，属生物技术领域。单克隆抗体的免疫原为ＨＩＶ－１Ｂ亚型ｐ２４基因工程重组蛋白；是由免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤ｐ３ＪＢ９、ｐ５Ｆ１和ｐ６Ｆ４细胞系分泌产生；属于免疫球蛋白ＩｇＧ１型；与猴免疫缺陷病毒ＳＩＶ↓［ＡＧＭ］、猴逆转录Ｄ型病毒ＳＲＶ交叉反应；与ＣＣＲ５嗜性病毒株ＨＩＶ↓［Ａｄａ－Ｍ］和耐药株ＨＩＶ↓［７４Ｖ］反应；ｐ５Ｆ１和ｐ６Ｆ４能与临床分离株ＨＩＶ↓［ＫＭＯ１８］反应，而ｐ３ＪＢ９不能与临床分离株ＨＩＶ↓［ＫＭＯ１８］反应。单克隆抗体可以与其它单克隆抗体或多克隆抗体组合，或可作放射性同位素、酶、荧光素化合物、化学发光化合物或胶体金属离子的标记，用于制备定性或定量检测各种体液、培养上清或细胞、组织中ｐ２４抗原的试剂。具有制备方法简单，效价高；单克隆抗体特异性强，灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)p24蛋白的单克隆抗体及其应用，更具体地说是利用基因工程制备重组HIV-1p24蛋白及其单克隆抗体，并用于HIV-1p24抗原的检测。
技术介绍
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球广泛流行，亚洲是继北美、非洲之后成为全球HIV(Human Immunodeficiency Virus)感染上升最迅速、流行最严重的地区之一。我国AIDS也呈加速流行的趋势。专家估计，我国实际HIV感染者累计超过100万，2003年底估计现存感染者人数为84万。截至2004年9月底，报告的艾滋病病毒感染者89,067例，其中艾滋病病例20,786例。HIV主要通过性、母婴和血液三种途径传播。为监控流行情况，评价新的疫苗和药物，建立简便、灵敏、特异的检测方法特别关键。检测HIV试剂包括抗体、抗原、核酸三大类。HIV-1p24蛋白是构成病毒核衣壳的主要结构蛋白。gag基因在病毒复制中扮演十分重要的角色。p24蛋白的氨基酸序列在HIV-1各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。HIV-1感染人体后，机体会产生针对p24抗原的免疫应答。HIV-1p24抗原的检测在早期诊断(1)、预测病程(2，3)、胎儿感染确诊、药物疗效评价(3，4)和基础研究(5)等方面具有重要意义。现在，以<酶联免疫分析(ELISA)为基础的测定p24抗原技术最为常用。美国专利公开号US 005,173,399，公开日1992年12月22日，专利技术创造的名称为Mouse monoclonal antibodies to hiv-1p24 and their use in diagnostic tests，该申请公开了一种抗人免疫缺陷病毒p24蛋白的单克隆抗体及其在检测中的应用。美国专利公开号US 004,888,290，公开日1989年12月19日，专利技术创造的名称为Monoclonalantibody specific to HIV antigens，该申请公开了一种抗人免疫缺陷病毒p55，p24蛋白的单克隆抗体KC-57。美国专利公开号US 004,886,742，公开日1989年12月12日，专利技术创造的名称为Enzyme immunoassay for detecting HIV antigens in human sera，该申请公开了一种检测人免疫缺陷病毒p24蛋白的方法，其不足之处是采用人阳性血清作为检测抗体，增加了非特异性反应的可能。经文献检索，未见与本专利技术相同文献的公开报道。参考文献1.Le Pont F et al.，Transfusion，1995，35:542. 2.DeGruttola V et al.，J Infect Dis，1994，169:713. 3.Varnier 0E et al.，AIDS Res Hum Retroviruses，1996，12565. 4.Chaisson RE et al.，N Engl J Med，1986，3151610. 5.Zheng YT，Ben KL，Jin SW，Acta Pharm Sin，2000，21179. 6.徐志凯等，1992，实用单克隆抗体技术，75-79
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺点，采用能降低非特异性反应的重组HIVp24免疫的兔血清作为检测抗体，提供一种HIV-1p24的单克隆抗体及检测人免疫缺陷病毒p24蛋白的方法。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案本专利技术的单克隆抗体的免疫原为纯化B亚型HIV-1p24基因工程重组蛋白，表达蛋白产物的分子量为24kDa。单克隆抗体源于HIV-1p24重组蛋白免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞。单克隆抗体p3JB9，p5F1和p6F4识别HIV-1p24的不同表位，p5F1识别表位DCKTILKALGPAATLEEMMTAC，位于HIV-1Gag蛋白上氨基酸329-350。单克隆抗体均为IgG1亚类。单克隆抗体不与猴免疫缺陷病毒SIVAGM、猴逆转录D型病毒SRV交叉反应。单克隆抗体p3JB9，p5F1和p6F4都能与HIV-1实验株HIV-1IIB、HIVAda-M和耐药株HIV74V反应；单克隆抗体p5F1和p6F4能与临床分离株HIVKM018反应。本专利技术的另一技术方案为用基因工程重组HIV-1p24作免疫原，通过免疫正常家兔，收集血清，从中分离纯化出抗人HIV-1p24多克隆抗体。本专利技术的抗HIV-1p24单克隆抗体和多克隆抗体，可以与其它单克隆抗体或多克隆抗体组合，用于各种体液、培养上清或各种细胞、组织中HIV-1p24抗原的定性或定量检测；可以作包括放射性同位素、酶、荧光素化合物、化学发光化合物或胶体金属离子在内的各种标记，用于各种体液、培养上清或各种细胞、组织中HIV-1p24抗原的定性或定量检测。HIV-1p24蛋白的单克隆抗体采用公知的方法制备，具体包括以下步骤(1)制备HIV-1p24的蛋白分别用表达HIV-1B亚型p24蛋白的E.coli表达系统大量表达GST-p24融合蛋白，用溶菌酶裂解细菌后，采用Parmacia Sepharose-4B GST亲和层析柱吸附GST融合蛋白，经PreScission蛋白酶在4℃过夜酶切，用洗脱缓冲液洗脱得到电泳纯HIV-1B亚型重组p24蛋白。(2)制备HIV-1p24蛋白特异性单克隆抗体用纯化的HIV-1p24蛋白背部皮下常规免疫6-8周的Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与NS-1小鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(PEG)作用下进行融合，用含20％小牛血清的HAT选择性培养基将融合的细胞培养10-14天，使其产生并增殖细胞克隆，然后更换为HT培养基。ELISA间接法检测培养上清中的抗体，以有限稀释法进行克隆化，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％。给每只Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml，1周后，将扩大培养的阳性单克隆细胞以5×105细胞/鼠注入液体石蜡致敏的小鼠腹腔，1-2周后收集腹水。采用Protein G亲和层析法纯化，得到IgG蛋白分子。制备HIV-1p24的多克隆抗体制备方法，该方法包括以下步骤(1)制备HIV-1p24的蛋白同“制备HIV-1p24的单克隆抗体制备方法”。(2)制备HIV-1p24蛋白特异性多克隆抗体纯化的抗原100ug/只，与等体积完全佛氏佐剂充分混合、乳化，肌肉注射及皮下多点注射正常家兔；4周后，相同量抗原与不完全佛氏佐剂充分混合、乳化，再次皮下多点注射；4周后，重复第二次免疫；末次免疫一周后耳缘静脉采血，收集血清，-20℃保存。通过ELISA、流式细胞术、免疫组化和Western blot将抗HIV-1p24蛋白的单克隆抗体及多克隆抗体用于制备检测HIV-1p24的试剂的应用。本专利技术的优点是本专利技术提供单克隆抗体和多克隆抗体的制备方法简单，效价高；单克隆抗体特异性强，灵敏度高；本专利技术可用于HIV-1p24抗原的检测，在HIV感染的早期诊断、预测病程、胎儿感染确诊和基础研究等方面具有重要意义。附图说明图1为p3JB9，p5F1和p6F4三株的杂交本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗人免疫缺陷病毒Ｉ型ｐ２４蛋白的单克隆抗体，其特征在于：（１）单克隆抗体的免疫原为ＨＩＶ－１Ｂ亚型ｐ２４基因工程重组蛋白，表达蛋白产物的分子量为２４ｋＤａ；（２）单克隆抗体ｐ３ＪＢ９，ｐ５Ｆ１和ｐ６Ｆ４识别ＨＩＶ－１ｐ２ ４的不同表位，ｐ５Ｆ１识别表位ＤＣＫＴＩＬＫＡＬＧＰＡＡＴＬＥＥＭＭＴＡＣ，位于ＨＩＶ－１Ｇａｇ蛋白上氨基酸３２９－３５０；（３）单克隆抗体属于免疫球蛋白ＩｇＧ１型；（４）单克隆抗体不与猴免疫缺陷病毒ＳＩＶ↓［ＡＧＭ］、猴逆 转录Ｄ型病毒ＳＲＶ交叉反应；（５）单克隆抗体ｐ３ＪＢ９，ｐ５Ｆ１和ｐ６Ｆ４都能与ＨＩＶ－１实验株ＨＩＶ－１↓［ＩＩＩＢ］、ＨＩＶ↓［Ａｄａ－Ｍ］和耐药株ＨＩＶ↓［７４Ｖ］反应；单克隆抗体ｐ５Ｆ１和ｐ６Ｆ４能与临床分离株ＨＩＶ↓［ＫＭ Ｏ１８］反应。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑永唐，刘广杰，杨柳萌，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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