结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的核衣壳蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：A、如SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列；B、与SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；C、在严格条件下与SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQ ID No.1‑2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列；其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的核衣壳蛋白。本发明专利技术还公开了上述核酸适配体的缀合物、衍生物及其应用。

【技术实现步骤摘要】
结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用。
技术介绍
引起严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyn-dromecoronavirus2，SARS-CoV-2)为一种新型的冠状病毒，具有棘突蛋白S(S蛋白)，核衣壳蛋白(N蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和膜蛋白(M蛋白)等数种主要结构蛋白，研究表明S蛋白是该病毒的主要保护性抗原，N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应，特别是N蛋白具有较强的免疫原性，2020年1月10日前后，新型冠状病毒基因组全序列由复旦大学上海市公共卫生临床中心提交至NCBIGenBank数据库，其中28274—29533位为“N”基因，可产生病毒核衣壳蛋白(N蛋白)。N蛋白是SARS-CoV主要的结构蛋白，在冠状病毒颗粒中，位于病毒颗粒的核心部分和基因组RNA结合，以往对动物冠状病毒结构蛋白的研究表明，N蛋白在病毒复制和产生的病理反应中起重要作用。新型冠状病毒可以人传人，对比SARS冠状病毒，SARS-CoV-2致死率低，但传播较快，因为SARS-CoV-2感染者会出现急性、严重呼吸道疾病，伴有发热、咳嗽、气短及呼吸困难，严重的病例还会出现肾功能衰竭和死亡，当前并无有效的治疗药物。新型冠状病毒检测方法目前也并不完善，需依赖特定仪器、特殊实验室和专业技术人员，且检测过程复杂，不能满足及时检测需求，且存在一定的漏检率。新型冠状病毒由于潜伏期具有传染性，为了排查很多无症状感染者，迫切需要发展现场、实时、便捷的家庭检测方法。已知N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中含量非常丰富，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。在抗击SARS病毒中，核衣壳蛋白已被证明是良好的诊断标记，目前新型冠状病毒结构与SARS病毒类似并且新型冠状病毒引起的肺炎，相应的疫苗、小分子药物甚至抗体药物都在开发中。目前检测方法主要是实时逆转录酶聚合酶链检测方法(rRT-PCR)。不管是小分子药物、疫苗或抗体的开发周期都较长，而筛选得到的新型冠状病毒核衣壳蛋白特异的核酸适配体既可以用于快速建立有效的检测方法，也可能用于新冠肺炎的治疗。新冠状病毒特异性的核酸适配体(aptamer)可以用于开发多种检测方法。核酸适配体是一种经SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术筛选得到的短链DNA或RNA序列，与对应的靶物质有特异的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体在病毒检测以及中和病毒方面的价值已被广泛证实，包括针对埃博拉、HIV，流感(H1N5、H9N2、H1N1)、乙肝、丙肝、病毒等。在point-of-caretesting(POCT)检测方面，适配体技术也表现出卓越的优势。相对于抗体而言，核酸适配体具有多方面的优势。如靶标广泛，不管是金属离子、有机小分子、小肽、蛋白质、病毒、细菌、细胞甚至病理组织，都可以筛选到相应的适配体。适配体可以通过体外实验快速获得，生产与质控远比抗体简单，直接化学合成即可，另外生产成本较低等。基于核酸适配体的识别机制和核酸可以配对的特点，可以设计出比抗体更多的检测技术，用于适应不同的应用场景。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用，本专利技术可以高度特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。本专利技术人使用体外指数富集的利用(SELEX)技术，筛选得到了特异性结合新型冠状病毒核衣壳核衣壳蛋白的核酸适配体。详细地，本专利技术人设计并合成了一个随机单链DNA文库及相应的引物，用来筛选具有亲和力高、特异性强、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，由此筛选得到2个特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，并检测了它们与新型冠状病毒核衣壳N蛋白的结合能力。在此基础上，本专利技术人完成了本专利技术。本专利技术提出的一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：A、如SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列；B、与SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；C、在严格条件下与SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列；其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。上述如SEQIDNo.1-2所示的DNA序列，其序列如下表所示：优选地，上述与SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列具有同源性，且能够特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的DNA序列，其同源性可以为至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％；例如可以通过在SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列上删除或增加部分互补的核苷酸。优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等中的至少一种。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，以上经修饰处理后的核酸适配体，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合；经修饰处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。本专利技术还提出了一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体缀合物，所述核酸适配体缀合物是在上述核酸适配体序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质。优选地，用于标记、检测、诊断或治疗的物质包括：荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽或siRNA中的至少一种。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，上述核酸适配体缀合物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合；上述核酸适配体缀合物可以保持或提高核酸适配体与新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。本专利技术还提出了一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体、核酸适配体缀合物序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：/nA、如SEQ IDNo.1-2所示的任意一个DNA序列；/nB、与SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；/nC、在严格条件下与SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列杂交的DNA序列；/nD、由SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列；/n其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：
A、如SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列；
B、与SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；
C、在严格条件下与SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列杂交的DNA序列；
D、由SEQIDNo.1-2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列；
其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。


2.根据权利要求1所述特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化中的至少一种。


3.一种特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体缀合物，其特征在于，所述核酸适配体缀合物是在权利要求1或2所述核酸适配体序列中连接上用于标记、检测、诊断或治疗的物质。


4.根据权利要求3所述特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何磊，张峥，徐涛，朱建国，张师杨，
申请(专利权)人：安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34