一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合哌替啶的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：A、如SEQ IDNo.1所示的DNA序列；B、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；C、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列；其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合哌替啶。本发明专利技术还公开了一种核酸适配体衍生物。本发明专利技术还公开了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备检测哌替啶的试剂盒或检测哌替啶的分子探针中的应用。本发明专利技术能与哌替啶特异性结合，且化学性质稳定，易于保存和标记。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用。
技术介绍
哌替啶别名：地美露，杜冷丁，度冷丁，唛啶，美吡利啶，利多尔，吡利啶，唛啶利多尔等，外文名：Pethidine；Alodan,；Dolantin；Demerol；Lydol；Mepadin；Meperidine等，其分子式为C15H21NO2，其分子结构如下所示：哌替啶是人工合成的阿片受体激动剂，属于苯基哌啶衍生物，是一种常应用于临床的合成镇痛药。哌替啶具有与吗啡类似的性质，其作用机理与吗啡相似，药理作用和临床应用与吗啡相同，但镇静、麻醉作用较小，仅相当于吗啡的1/10—1/8，作用时间可维持2—4小时左右，主要作用于中枢神经系统，对心血管、平滑肌亦有一定影响，毒副作用也相应较小，恶心、呕吐、便秘等症状均较轻微，对呼吸系统的抑制作用较弱，一般不会出现呼吸困难及过量使用等问题。哌替啶反复作用可成瘾，连续使用1-2周便可产生药物依赖性，不良反应与吗啡相似，被列为严格管制的麻醉药品。1987年国务院发布的《麻醉药品管理办法》将哌替啶列入其中进行严格管理。所以无论从其药理作用、成瘾性，对人体的危害，还是从法律文件规定上讲，哌替啶是一种毒品。目前哌替啶等毒品的检测方法有很多种，例如：免疫筛选法；气相色谱法，高效液相色谱等方法，色谱的方法虽然检测的灵敏度较高，检测结果准确，但是需要昂贵的仪器设备，对检测材料的要求很高，需要提纯处理等，无法实现快速便捷的检测。目前的免疫筛选法都是依赖于抗体做的检测试剂盒，虽然有一些可以做到快速简单的检测，但是抗体制备过程比较复杂，批次之间有差异，也有一定的缺陷。核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。基于SELEX的方法，筛选出结合特定小分子的核酸适配体，并将该核酸适配体用于小分子的检测，目前也被广泛研究。针对于哌替啶的核酸适配体还没有人公布，因此，本领域对针对哌替啶有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用，本专利技术能与哌替啶特异性结合，且化学性质稳定，易于保存、易于标记。本专利技术提出的一种特异性结合哌替啶的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：A、如SEQIDNo.1所示的DNA序列；B、与SEQIDNo.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；C、在严格条件下与SEQIDNo.1所示DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQIDNo.1所示DNA序列转录的RNA序列；其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合哌替啶。优选地，上述与SEQIDNo.1所示DNA序列具有同源性，且能够特异性结合哌替啶的DNA序列，其同源性可以为60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或99％以上。专利技术人采用磁珠法，采用小分子竞争结合的方法筛选特异性结合哌替啶的核酸适配体，具体过程参见图1，图1为磁珠法筛选流程图：采用起始文库(ssDNAlibrary)通过其正向引物区的序列与连接有biotin的正向引物互补序列(Biotincaptureoligonucleotide)配对，然后biotin可以与链霉亲和素磁珠(streptavidin-beads)结合，从而将起始文库固定在磁珠上。接着与靶标哌替啶(meperidine)孵育，哌替啶会与有亲和力的序列结合，从而将其从biotin修饰的正向引物互补序列上竞争下来，该步骤即为洗脱步骤，获得的能与哌替啶结合的文库溶液(Elution)，再经PCR扩增、提纯、电泳制备单链等处理获得次级文库，以次级文库作为下一轮筛选的起始文库进行多轮筛选，具体共计筛选六轮获得特异性结合哌替啶的核酸适配体，简称其为meperidine-17，其序列为：5’-GGCACTCCACGCATAGGATGGTTTAACCAGCCGTGTGCGTGGATGTGTTCGGCAGCTCC-3’。优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。优选地，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶。以上经修饰或连接处理后的核酸适配体，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与哌替啶的结合；经修饰或连接处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与哌替啶的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。本专利技术还提出了一种核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体改造成的肽核酸。上述核酸适配体衍生物与原核酸适配体具有基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能。硫代磷酸酯骨架序列修饰是最简单和广泛使用的可应用于增加核酸酶抗性的化学修饰，未经修饰的核酸适配体可以显示活性，但他们会被核酸酶迅速降解，因此作用有限。在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，有很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞。上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。本专利技术还提出了上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物在制备检测哌替啶的试剂盒或检测哌替啶的分子探针中的应用。可以用上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物来检测受试者血液、尿液、毛发中的哌替啶的含量。专利技术人使用磁珠法，采用小分子竞争结合的方法，通过六轮的筛选获得了一个特异性结合哌替啶的核酸适配体meperidine-17，其具有高度特异性，能与哌替啶特异性结合，且化学性质稳定，易于保存、易于标记；基于核酸适配体meperidine-17对哌替啶的亲和力和特异性，可以用核酸适配体meperidine-17制备试剂盒或分子探针用于识别、检测哌替啶。附本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合哌替啶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：/nA、如SEQ IDNo.1所示的DNA序列；/nB、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；/nC、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；/nD、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列；/n其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合哌替啶。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合哌替啶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：
A、如SEQIDNo.1所示的DNA序列；
B、与SEQIDNo.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；
C、在严格条件下与SEQIDNo.1所示DNA序列杂交的DNA序列；
D、由SEQIDNo.1所示DNA序列转录的RNA序列；
其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合哌替啶。


2.根据权利要求1所述特异性结合哌替啶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：方晓娜，罗昭锋，韦唯，张立云，盛六四，何磊，
申请(专利权)人：安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34