本发明专利技术公开了一种特异性结合PD‑1蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：A、如SEQ ID No.1所示的DNA序列；B、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；C、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列；其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合PD‑1蛋白。本发明专利技术还公开了一种核酸适配体衍生物。本发明专利技术还公开了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物的应用。本发明专利技术能与PD‑1蛋白特异性结合，且化学性质稳定，易于保存和标记。
【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体及其应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体及其应用。
技术介绍
肿瘤是指机体局部组织的细胞异常增生而形成的一种新生物，常常表现为局部的肿块。根据肿瘤的性质，一般将其分为良性肿瘤和恶性肿瘤。恶性肿瘤生长较快，易向周围组织扩散，容易发生转移，危及生命。PD-1(programmedcelldeathprotein1)蛋白是T细胞表面的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白，为CD28超家族成员。一些肿瘤细胞能够表达PD-L1或PD-L2与T细胞表面的PD-1结合，使PD-1的胞内结构域的酪氨酸磷酸化，抑制TCR信号通路，从而逃避T细胞的杀伤。因此，理论上可通过使用PD-1抑制剂例如PD-1抗体来对抗该免疫逃避机制，从而达到治疗的目的。PD-1核酸适配体(aptamer)可以用于开发应用多种检测试剂盒和肿瘤治疗药物。核酸适配体是一种经SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术筛选得到的短链DNA或RNA序列，与对应的靶物质有特异的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体在病毒检测以及中和病毒方面的价值已被广泛证实，包括针对埃博拉、HIV，流感(H1N5、H9N2、H1N1)、乙肝、丙肝、病毒等。在point-of-caretesting(POCT)检测方面，适配体技术也表现出卓越的优势。相对于抗体而言，核酸适配体具有多方面的优势。如靶标广泛，不管是金属离子、有机小分子、小肽、蛋白质、病毒、细菌、细胞甚至病理组织，都可以筛选到相应的适配体。适配体可以通过体外实验快速获得，生产与质控远比抗体简单，直接化学合成即可，另外生产成本较低等。基于核酸适配体的识别机制和核酸可以配对的特点，可以设计出比抗体更多的检测技术，用于适应不同的应用场景。针对于PD-1(programmedcelldeathprotein1)蛋白的核酸适配体目前报道的还很少，因此，本领域对与PD-1蛋白有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体及其应用，本专利技术能与PD-1蛋白特异性结合，且化学性质稳定，易于保存和标记。本专利技术提出的一种特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：A、如SEQIDNo.1所示的DNA序列；B、与SEQIDNo.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；C、在严格条件下与SEQIDNo.1所示DNA序列杂交的DNA序列；D、由SEQIDNo.1所示DNA序列转录的RNA序列；其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合PD-1蛋白。优选地，上述与SEQIDNo.1所示DNA序列具有同源性，且能够特异性结合PD-1蛋白的DNA序列，其同源性可以为至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。上述与SEQIDNo.1所示DNA序列具有同源性的DNA序列，可以通过在SEQIDNo.1所示DNA序列上删除或增加部分互补的核苷酸等方法获得。专利技术人基于磁珠筛选和单分子流式分选筛选的方法，获得了特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体。具体过程是，专利技术人设计并合成了一个随机单链DNA文库及相应的引物，用来筛选具有亲和力高、特异性强、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的与PD-1蛋白结合能力强的核酸适配体，由此筛选得到一些特异性好、与PD-1蛋白亲和力强的核酸适配体，并通过SPR检测了核酸适配体与PD-1蛋白的结合能力，并最终得到如本专利技术SEQIDNo.1所示的核酸适配体序列。另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行截断，截断的目的主要是为了获得更高的结合PD-1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。优选地，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，以上经截断、修饰或连接处理后的核酸适配体，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与PD-1蛋白的结合；经截断、修饰或连接处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与PD-1蛋白的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。本专利技术还提出了一种特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体改造成的肽核酸。上述核酸适配体衍生物与原核酸适配体具有基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能。硫代磷酸酯骨架序列修饰是最简单和广泛使用的可应用于增加核酸酶抗性的化学修饰，未经修饰的核酸适配体可以显示活性，但他们会被核酸酶迅速降解，因此作用有限。在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，有很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞。上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。本专利技术还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提出了上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在PD-1蛋白的检测试剂盒、PD-1蛋白的检测探针中的应用。本专利技术所提供的核酸适配体、或其截断核酸适配体、核酸适配体衍生物可以高度特异性结合PD-1蛋白，其相对蛋白抗体而言，具有能够化学合成、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记等优点；其可以用于PD-1蛋白的检测，还可以用于抗肿瘤药物的靶向治疗。附图说明图1为流式检测PS微珠偶联氨基引物的效率结果，其中，a为流式检测的图，b为根据a中各样品的平均荧光值得到的图。图2为用流式检测双链扩增的效率结果，其中，PS-对照为仅偶联氨基引物的PS微珠，PS-dsDNA为PS-dsDNA微珠。图3为单分子流式分选第4、5轮的分选时的流式图。图4为实施例1筛选得到的富集文库与PD-1蛋白的结合情况，其中，p0、p4、p5分别为pool0、pool4、pool5经过通道1的结果，p0+PD1、p4+PD1、p5+PD1分别为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：/nA、如SEQ ID No.1所示的DNA序列；/nB、与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；/nC、在严格条件下与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交的DNA序列；/nD、由SEQ ID No.1所示DNA序列转录的RNA序列；/n其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合PD-1蛋白。/n
【技术特征摘要】
1.一种特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：
A、如SEQIDNo.1所示的DNA序列；
B、与SEQIDNo.1所示DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；
C、在严格条件下与SEQIDNo.1所示DNA序列杂交的DNA序列；
D、由SEQIDNo.1所示DNA序列转录的RNA序列；
其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合PD-1蛋白。
2.根据权利要求1所述特异性结合PD-1蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
3.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗昭锋，王进军，张立云，方晓娜，
申请(专利权)人：安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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