心肌肌钙蛋白I特异性核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种特异性结合心肌肌钙蛋白I(以下简称cTnI蛋白)的单链DNA核酸适配体，其包含SEQ ID Nos.1‑3中任一个所示的核苷酸序列。本发明专利技术的核酸适配体还可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明专利技术序列得到的衍生物。本发明专利技术的核酸适配体与心肌肌钙蛋白I的结合能力更强，且序列更短，还具有分子量小、易于合成、生产时间短、合成的成本更低等优点。本发明专利技术还提供所述单链DNA核酸适配体的应用，它们可以单独地或组合地用于cTnI蛋白纯化或cTnI蛋白检测。本发明专利技术还提供一种用于检测cTnI蛋白的试剂盒，其包含本发明专利技术的单链DNA核酸适配体。

【技术实现步骤摘要】
心肌肌钙蛋白I特异性核酸适配体及其应用
本专利技术涉及生物和医学领域，特别涉及一种可用于结合心肌肌钙蛋白I(CardiactroponinI，cTnI)的核酸适配体和应用。
技术介绍
心血管疾病是当今社会影响人类健康的重要疾病之一，而在心血管疾病中急性心肌梗死是造成患者死亡的重要原因。心肌损伤标志物异常是诊断心肌梗死的主要依据之一，所以现阶段有不少用于早期心肌损伤血清标志物的诊断试剂。心肌肌钙蛋白I(CardiactroponinI，cTnI)是一种心肌的特异性蛋白，其对微小心肌损伤检测有特殊临床价值，正常时，循环中的cTnI水平很低，当心肌细胞受到损伤后，cTnI先于其它生化指标快速进入血液，在3-5小时内升高，随着损伤的加重，其在血液中的浓度不断升高，12-36小时内达到高峰，形成较长的时间窗。大量研究表明，cTnI已被证实是心肌细胞损伤最特异和最敏感的血清标志物之一。因此，快速、敏捷且准确检测cTnI具有重要的临床意义。核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。得到核酸适配体后通常会对得到的核酸适配体序列进行相关的修饰改造，以期获得性能更佳的核酸适配体，其中将序列截短是一个重要的手段，主要是将一些与靶标相互作用不重要的部分移除。目前已经有一些研究者公布了他们所获得的一些cTnI蛋白的核酸适配体序列。然而，受制于现有核酸适配体筛选技术手段，得到的核酸适配体并不是与靶标结合的最简序列，亲和力和稳定性也不是最优。在实际应用中将会导致成本增加，稳定性低，因此对具有更短序列、亲和力更高、稳定性更高的cTnI核酸适配体存在需求。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了三种心肌肌钙蛋白I核酸适配体及其应用。本申请专利技术人基于其先前申请中通过SELEX方法得到的特异性结合cTnI的序列cTnI-14：5’TTCAGCACTCCACGCATAGCTACGGCGGCTACAATGCAGTGGGGAGGGACTTGTTGTAACCCTATGCGTGCTACCGTGAA3’(80nt)进行了改造，通过分析结合的关键区域，将序列简化，去除了结合的无关序列，从而得到本专利技术的这三条针对于心肌肌钙蛋白的核酸适配体，并检测了它们与cTnI蛋白的结合能力。得到的三条新的序列与原序列相比结合能力更强，序列更短，易于合成，成本也更低。在此基础上，本专利技术人完成了本专利技术。在第一方面，本专利技术提供一种特异性结合cTnI蛋白的核酸适配体，其包含SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列，或与SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合cTnI蛋白的核苷酸序列，或由SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合cTnI蛋白的核苷酸序列。其中所述的高同源性可以是与SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。由表面等离子共振法检测的核酸适配体(SEQIDNos.1-3)与cTnI的结合常数均为pM级别，说明本专利技术提供的核酸适配体与目标蛋白有很高的亲和力。优选地，本专利技术的特异性结合cTnI蛋白的核酸适配体由SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列组成。其中SEQIDNos.1-3所示的核苷酸序列分别显示如下：SEQIDNo.1(cTnI-14-7)：5’-CCAATGCAGTGGGGAGGGACTGCGTTGG-3’SEQIDNo.2(cTnI-14-3)：5’-CCAATGCAGTGGGGAGGGACTTGTTGG-3’SEQIDNo.3(cTnI-14-16)：5’-CCAATGCAGTGGGGGGACTTGTTGG-3’另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合cTnI蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性，或者带有特殊的发光基团便于观察。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合cTnI蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与cTnI蛋白结合。作为一个总的技术构思，本专利技术所述的核酸适配体也可以包含以下三种序列中的任意一种：(1)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上的核苷酸序列(例如可将前述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸)，优选地，同源性可以为70％以上，80％以上，90％以上，或者99％以上；优选与SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列具有60％以上的同源性的核苷酸序列，优选地，与SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列的同源性可以为70％以上，80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，或者99％以上；(2)能够与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列；或(3)由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列；其中，上述(1)-(3)中的核苷酸序列均能够特异性结合cTnI蛋白。术语“同源性”是指使用本领域已知的方法(诸如，序列比较算法)，当在比较窗口上以最大一致性比较和对齐时，两个或多个序列具有指定百分比的在指定区域上相同的核苷酸。两个序列之间的“同源性”百分比可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul,StephenF.,ThomasL.Madden,AlejandroA.JinghuiZhang,ZhengZhang,WebbMiller,和DavidJ.Lipman(1997),“GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms”,NucleicAcidsRes.)使用默认参数来确定。术语“严格条件”是指在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合心肌肌钙蛋白I的核酸适配体，其中所述核酸适配体包含或由以下组成：SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列，或与SEQ ID Nos.1-3中任一个所示的核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合心肌肌钙蛋白I的核苷酸序列，或由SEQ IDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合心肌肌钙蛋白I的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合心肌肌钙蛋白I的核酸适配体，其中所述核酸适配体包含或由以下组成：SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列，或与SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合心肌肌钙蛋白I的核苷酸序列，或由SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合心肌肌钙蛋白I的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其中所述心肌肌钙蛋白I的核酸适配体的核苷酸序列被修饰，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。


3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其中所述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记。


4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其由SEQIDNos.1-3中任一个所示的核苷酸序列组成。


5.一种特异性结合心肌肌钙蛋白I的核酸适配体，其中所述核酸适配体包含以下三种序列中的任意一种或由其组成：
(...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昭锋，方晓娜，何军林，王进军，张立云，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34