一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体，包括以下三种序列中的至少一种：(1)SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体及其和应用。

技术介绍

[0002]T细胞的激活不仅通过T细胞受体的抗原刺激介导，还通过某些共刺激分子诱导共刺激信号，共刺激分子肿瘤坏死因子(TNF)超家族的LES在调节免疫应答和诱导双向信号方面发挥重要作用。肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)和肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)的成员OX40(CD 134)和OX40L(CD 252)在T细胞的增殖和存活中发挥着重要作用，在肿瘤、感染性、炎症和自身免疫性疾病中也均有异常表达。
[0003]OX40，又名Tnfrsf4(Tumor necrosis factor receptor superfamily,member 4)，具有协同刺激功能，是一种50kD的糖蛋白，有一个细胞质尾部，一个跨膜结构域和细胞外区域。主要在表达于激活的CD4+和CD8+T细胞表面，和OX40L结合可以刺激CD8+T细胞的活化。通过OX40/OX40L信号的共激活效应，T细胞的功能，包括细胞因子的产生、增殖和T细胞的存活等作用将被进一步加强。OX40抗体激活剂(Agonist)可降低肿瘤内Tregs，提高抗肿瘤活性。目前公开的数据显示，有多种OX40的抗体药物已经进入临床研究阶段，后续越来越多的OX40抗体药物将会进入到临床阶段，OX40靶点药物研发市场具有很大的开发潜力，和其抗体有相似功能的OX40/OX40L核酸适配体用于肿瘤免疫治疗的可行性也被广泛研究。
[0004]核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。
[0005]基于SELEX的筛选原理，OX40/OX40L核酸适配体用于肿瘤免疫治疗的可行性也被广泛研究。目前已经有一些研究者公布了他们所发现的一些OX40的核酸适配体序列，并在小鼠模型上验证了其抗肿瘤增殖的能力，发现OX40/OX40L核酸适配体和OX40/OX40L抗体具有相似的抗肿瘤免疫功效。然而这些OX40/OX40L的核酸适配体存在一些缺点，例如，有些核酸适配体的靶标是鼠源OX40/OX40L蛋白，实际应用受限；有些核酸适配体分子量大，针对OX40蛋白的结合亲和力不太高、特异性不好、稳定性不高等。因此，本领域对具有针对人源OX40/OX40L蛋白的结合亲和力更高的核酸适配体存在需求。

技术实现思路

[0006]基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合OX40蛋白的核酸适配体、核酸适配体的缀合物、核酸适配体的衍生物及其应用。
[0007]本专利技术提出的一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的至少一种：
[0008](1)SEQ ID NO:1
‑
4中任意一个所示的DNA序列，其中：
[0009]SEQ ID NO:1是
[0010]TCCAGCACTCCACGCATAACCCACACACCGTGTCTGCCCTCCGGTCCCCGCATTAGGTTATGCGTGCGACGGTGAA，
[0011]SEQ ID NO:2是
[0012]TCCAGCACTCCACGCATAACTCCCGCTCCGATCGCGTGCGTTGACACCGTGTCCGGGTTATGCGTGCGACGGTGAA，
[0013]SEQ ID NO:3是
[0014]TCCAGCACTCCACGCATAACCACATCGGTCGGGCTGCTCGAGGCTTGCGCAAACCAGTTATGCGTGCGACGGTGAA，
[0015]SEQ ID NO:4是
[0016]TCCAGCACTCCACGCATAACCCCCCCCTGCACCCCAGGTCTTCCGCGCCCGGACGAGTTATGCGTGCGACGGTGAA；
[0017](2)与SEQ ID NO:1
‑
4中任意一个所示的DNA序列具有60％以上同源性且特异性结合OX40蛋白的DNA序列，优选可以是70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上、98％以上、99％以上；
[0018](3)由SEQ ID NO:1
‑
4中任意一个所示的DNA序列转录且特异性结合OX40蛋白的RNA序列。
[0019]另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合高表达OX40蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
[0020]在另一方面，本专利技术还提供核酸适配体的缀合物。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光标记物，例如放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合高表达OX40蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
[0021]换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与高表达OX40蛋白的结合。
[0022]作为一个总的专利技术构思，本专利技术还提供了一种核酸适配体的衍生物，其是将所述核酸适配体或者所述核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成硫代磷酸酯骨架而得，或者是将所述核酸适配体或者所述核酸适配体的缀合物改造成的肽核酸，条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都与高表达OX40蛋白结合。
[0023]本专利技术所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。
[0024]本专利技术所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成DNA分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合OX40蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的至少一种：(1)SEQ ID NO:1
‑
4中任意一个所示的DNA序列，其中:SEQ ID NO:1是TCCAGCACTCCACGCATAACCCACACACCGTGTCTGCCCTCCGGTCC CCGCATTAGGTTATGCGTGCGACGGTGAA，SEQ ID NO:2是TCCAGCACTCCACGCATAACTCCCGCTCCGATCGCGTGCGTTGACACC GTGTCCGGGTTATGCGTGCGACGGTGAA，SEQ ID NO:3是TCCAGCACTCCACGCATAACCACATCGGTCGGGCTGCTCGAGGCTTG CGCAAACCAGTTATGCGTGCGACGGTGAA，SEQ ID NO:4是TCCAGCACTCCACGCATAACCCCCCCCTGCACCCCAGGTCTTCCGCG CCCGGACGAGTTATGCGTGCGACGGTGAA；(2)与SEQ ID NO:1
‑
4中任意一个所示的DNA序列具有60％以上同源性且特异性结合OX40蛋白的DNA序列；(3)由SEQ ID NO:1
‑
4中任意一个所示的DNA序列转录且特异性结合OX40蛋白的RNA序列。2.根据权利要求1所述的特异性结合OX40蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体特异性结合OX40蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。3.一种核酸适配体的缀合物，其特征在于，其是在权利要求1或2所述核酸适配体的核苷酸序列上...

【专利技术属性】
技术研发人员：方晓娜，何磊，张立云，周宏敏，
申请(专利权)人：安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：