用于质谱法的电离修饰剂制造技术

本发明专利技术涉及通式（Ⅰ）的化合物，其中Ｒ、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、Ｒ””、Ｘ和ｎ如说明书和权利要求书中所定义，本发明专利技术还涉及所述化合物作为电离修饰剂的用途。本发明专利技术进一步涉及对来自含有标记和未标记形式的所述多肽的来源的多肽或其片段进行定量的方法，其包括：（ａ）用电离修饰剂修饰分离的多肽，（ｂ）通过质谱法分析制备的多肽或其片段，并且由此测定多肽或其片段的来源中存在的多肽或其片段的量。

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
在分析蛋白质生物化学中，质谱法已经发展成了一种多用途技术。选择的仪器类型为MALDI-TOF质谱仪，并且针对用胰蛋白酶或内蛋白酶(endoproteinase)-C形式的内肽酶裂解所产生的分子量为0.8-3kDa的肽类对分析窗进行优化。然而，尽管裂解过程被设计用于产生可确保电离的基础残基(basicresidue)均质分布的肽这一事实，但是一些分子比其它分子更易于检测。这是由于可导致一些肽完全猝灭的电离竞争所致。一个突出的实例是阿尔茨海默病淀粉样肽(Alzheimer’s amyloid peptide)(Aβ)。已知用内肽酶Lys-C产生的Aβ的三个肽片段表现极为不同(Grüninger等2000，使用基于质谱法的检测系统鉴定β-分泌酶样活性(Identification of beta-secretase-likeactivity using a mass spectrometry-based assay system).NatureBiotechnology，1866-70)。氨基末端片段和中间片段具有极佳的电离特性，但是使用优选的MALDI-TOF方法从未检测到羧基末端片段(Rüfenacht等2005，使用与质谱法组合的激光切割显微术对阿尔茨海默病斑块中的Aβ肽进行定量(Quantification of the Aβpeptide in Alzheimer’s plaques bylaser dissection microscopy combined with mass spectrometry).J.MassSpectrom.；40193-201)。但是羧基末端被认为是淀粉样肽的关键部分。Aβ以不同链长出现。大部分肽终止于残基40，而少量肽终止于残基42。较长的形式具有高得多的成纤维倾向并且因此被认为是产生问题的原因。此外，具有意义的是区分通过修饰产生的不同Aβ种类，例如Aβ(11-16)和Aβ(pyroGlu11-16)片段(Huse等，2002，高尔基体外侧网络中的γ-分泌酶加工优先产生在阿尔茨海默病大脑中蓄积的截短的淀粉状蛋白种类(γ-Secretase processing in the trans-Golgi network preferentially generatestruncated amyloid species that accumulate in Alzheimer’s disease brain).J.Biol Chem.27716278-16284)或除了天然形式的甲硫氨酸外还在35位上带有甲硫氨酸亚砜的Aβ。Hou等(甲硫氨酸-35氧化减少阿尔茨海默病的淀粉样Ab-(1-42)肽的原纤维装配(Methionine-35 oxidation reduces fibrilassembly of the amyloid Ab-(1-42)peptide of Alzheimer’disease).J.Biol.Chem.(2002)27740172-40176)证实在生理pH下Met-35侧链氧化成甲硫氨酸亚砜(Met-35(ox))显著妨碍42-残基Aβ-(1-42)的原纤维形成速率。Met-35(ox)还改变特征性Aβ原纤维形态并且防止初原纤维形成，而它是β-淀粉样变和相关神经毒性的关键中间体。因此，强烈需要一种用于检测这类以前用质谱法无法检测的分子的方法。因此，本专利技术涉及修饰多肽并因此使得可用质谱法检测以前用该方法无法检测的多肽的新分子。
技术实现思路
本专利技术提供了以下通式的化合物 n＝0、1、2、3、4、5、6、7或8；X＝H、OH、F、Cl、Br、CH3、C2H5、C3H7或C4H9；R＝无残基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9；R’＝无残基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9；R”＝H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9；R＝H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9； R””＝H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9；或者R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””彼此键合与它们所连接的氮原子一起形成环，并且R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””一起为-CH2-(CH2)p-，其中p为1、2或3；或者X和R彼此键合与它们所分别连接的氮原子和碳原子一起形成环，并且X和R一起为-(CH2)k-，其中k为1、2、3或4。优选地，n＝1，X＝OH或H，R＝H，R’＝无残基，R”＝H，R＝H且R””＝H。也优选其中n＝4、X＝H、R＝H、R’＝无残基、R”＝H、R＝H且R””＝H的上述化合物。X决定在分析物与电离修饰剂之间产生酰胺键的转化反应的反应性。当X为Cl或Br时，在复合峰型中鉴别出修饰的胺是可能的。电离修饰剂中含有的氯或溴以同位素混合物的形式存在并且产生不同的双带型。当用这类标记修饰分析物时，可通过峰型从其它峰中容易地鉴别出相应的加合物。本专利技术进一步提供了上述化合物作为电离修饰剂的用途。本文所用的术语“电离修饰剂”或“飞行修饰剂”指的是能够结合所关注的多肽并且通过结合改变所关注的多肽在质谱法中的行为的分子。电离修饰剂能够接受或提供至少一个电子。优选地，电离修饰剂对一种氨基酸(即赖氨酸)具有特异性。本文所用的术语“多肽”或“所关注的多肽”指的是不同长度的氨基酸链。多肽可以是蛋白质或其片段或者肽或其片段。优选地，多肽是β-淀粉样肽Aβ1-40和Aβ1-42的C-末端片段，如例如Aβ(29-40)和Aβ(29-42)。此外，本专利技术提供了对来自包含标记和未标记形式的所关注的多肽的来源的所述多肽进行定量的方法，所述方法包括以下步骤(a)用电离修饰剂修饰分离的多肽；(b)通过质谱法分析制备的多肽，并且由此测定多肽来源中存在的所关注的多肽的量。本专利技术的一个实施方案涉及对所关注的多肽进行定量的方法，其包括(a)提供多肽来源；(b)将确定量的用稳定同位素标记的多肽加入到(a)的来源中；(c)分离未标记和标记的所关注的多肽；(d)制备分离的所关注的多肽用于通过质谱法进行分析；(e)用电离修饰剂修饰分离的多肽；(f)通过质谱法分析制备的所关注的多肽；和(g)测定多肽来源中存在的所关注的多肽的量。所关注的多肽的来源可以是体液，例如血液，或者所关注的多肽可以获自组织样品(例如匀浆的脑样品)或细胞培养物。组织样品、体液或细胞培养物可以是哺乳动物组织样品、哺乳动物体液或哺乳动物细胞。优选的组织样品、细胞和体液来源于人或小鼠。在所述的来源中，所关注的多肽可以以可溶性或聚集的形式存在。聚集的所关注的多肽可以形成斑块，由此本文所用的术语“斑块”指的是聚集的多肽的沉着物。可以通过包括一般生物化学多肽纯化方法的方法和包括激光切割显微术的用于从组织中特异性切下结构的方法从组织样品中获得含有聚集的多肽的所关注的多肽的来源(即含有聚集的β淀粉状蛋白的淀粉样沉着物)。激光切割显微术方法包括低温消融(cold ablation)和激光压力弹射步骤(Schütze等(1998)，通过激光介导的单细胞操作鉴定表达的基因(Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation o本文档来自技高网...

【技术保护点】
以下通式的化合物：＊＊＊其中：ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７或８；Ｘ＝Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ↓［３］、Ｃ↓［２］Ｈ↓［５］、Ｃ↓［３］Ｈ↓［７］或Ｃ↓［４］Ｈ↓［９］；Ｒ＝无残基、Ｈ、ＣＨ ↓［３］、Ｃ↓［２］Ｈ↓［５］、Ｃ↓［３］Ｈ↓［７］或Ｃ↓［４］Ｈ↓［９］；Ｒ’＝无残基、Ｈ、ＣＨ↓［３］、Ｃ↓［２］Ｈ↓［５］、Ｃ↓［３］Ｈ↓［７］或Ｃ↓［４］Ｈ↓［９］；Ｒ”＝Ｈ、ＣＨ↓［３］、Ｃ↓［２］Ｈ↓［５］、Ｃ↓ ［３］Ｈ↓［７］或Ｃ↓［４］Ｈ↓［９］；Ｒ”’＝Ｈ、ＣＨ↓［３］、Ｃ↓［２］Ｈ↓［５］、Ｃ↓［３］Ｈ↓［７］或Ｃ↓［４］Ｈ↓［９］；　Ｒ””＝Ｈ、ＣＨ↓［３］、Ｃ↓［２］Ｈ↓［５］、Ｃ↓［３］Ｈ↓［７］或Ｃ↓［４］Ｈ↓［９］ ；或者Ｒ’和Ｒ”或Ｒ”和Ｒ”’或Ｒ”’和Ｒ””或Ｒ和Ｒ””彼此键合与它们所连接的氮原子一起形成环，并且Ｒ’和Ｒ”或Ｒ”和Ｒ”’或Ｒ”’和Ｒ””或Ｒ和Ｒ””一起为：－ＣＨ↓［２］－（ＣＨ↓［２］）↓［ｐ］－，其中ｐ为１ 、２或３；或者Ｘ和Ｒ彼此键合与它们所分别连接的氮原子和碳原子一起形成环，并且Ｘ和Ｒ一起为：－（ＣＨ↓［２］）↓［ｓ］－，其中ｓ为１、２、３或４。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H多贝利，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]