单克隆抗体介导的呋喃西林残留检测方法及其应用，属于药物残留检测领域。本发明专利技术以抗呋喃西林单克隆抗体为介导建立呋喃西林残留ＥＬＩＳＡ快速检测方法，可就用于制作检测试剂盒和检测试纸条，可方便地对呋喃西林残留量进行ＥＬＩＳＡ快速。该方法相对于液质联用色谱仪分析法，对样品的前处理要求较低，分析过程很简单，检测时间较短，而且检测灵敏度也较高，使用成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物残留检测领域。
技术介绍
硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药理动力学特性，除了作为一种抗生素被应用于兽医医疗中外，它还曾作为猪、禽与水产品促生长的添加剂被广泛应用。但在长时间的实验室研究过程中发现，硝基呋喃类药物及其代谢产物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，鉴于此，欧盟分别于1993年(欧盟法令2901/93)与1995年(欧盟法令1442/95)立法禁止在动物源性食品生产加工过程中使用呋喃它酮(Furaltadone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃咀啶(Nitrofurantoin)与呋喃唑酮(Furazolidone)等四种药物。其后，美国、加拿大、澳新与日本等国均全面禁止使用硝基呋喃类药物。2002年3月我国也将硝基呋喃类药物列为禁用兽药。研究证明，硝基呋喃类药物在动物体内若干小时就会迅速分解成硝基呋喃与各种代谢产物，这些代谢产物与组织内蛋白质形成较为稳定的化合物，该化合物可以在组织中存留较长时间，所以分析此类药物残留时应该对其代谢产物进行检测分析，欧盟等国就是以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃残留的目的。四种硝基呋喃类药物的代谢产物分别对应为呋喃它酮-3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮(AMOZ)；呋喃西林—氨基脲(SEM)；呋喃咀啶-1-氨基咀啶(AHD)；呋喃唑酮-3-氨基-2-氧唑酮(AOZ)。随着我国加入世贸组织一年多以来，欧美日等发达国家利用自身技术优势对我国出口食品及农副产品不断设置新的技术壁垒措施，以达到限制我国食品与农副产品的出口，有关这方面的贸易纠纷接踵而来，欧盟早在2000年初就开始了一项长达42个月的FoodBRAND计划(QLK1-1999-00142)，其主要目的是要求欧盟各认可实验室对食品中硝基呋喃类残留检测方法(包括ELISA与LC-MS-MS方法)进行攻关研究，以为其设置技术壁垒提供技术支持。目前，欧盟规定不得在食品中检测出硝基呋喃类药物四种代谢产物残留，鉴于此，欧盟已研制出液质联用色谱仪检测硝基呋喃类代谢产物的分析方法。而我国原有检测方法仅是针对硝基呋喃类原药的，而且检测方法极为落后，已肯定不能满足出口的需求。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是为人们提供一种呋喃西林残留快速检测方法。本专利技术以抗呋喃咀啶单克隆抗体为介导建立呋喃西林残留ELISA快速检测方法。呋喃西林残留的快速检测方法包括以下步骤1)将还原好的呋喃西林与卵清蛋白重氮化法偶联合成抗原SEM-OVA；2)将合成抗原SEM-OVA包被到酶标板；3)以5％脱脂奶粉满孔封闭；4)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；5)将抗呋喃西林单克隆抗体与SEM标准液在板外作用后加入到洗涤好的包被板上；6)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；7)加入酶标抗体，进行孵育；8)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；9)加入底物溶液；10)加入终止液，终止反应；11)测定OD490nm值。本专利技术利用免疫学原理制备针对呋喃西林及其代谢产物氨基脲(SEM)特异的单克隆抗体，建立酶联免疫吸附试验(ELISA)以检测呋喃西林及其代谢产物氨基脲(SEM)，该方法相对于液质联用色谱仪分析法，其对样品的前处理要求较低，分析过程很简单，检测时间较短，而且检测灵敏度也较高，使用成本低，为我国畜禽产品进出口贸易中氨丙啉药物残留检测提供一种高效、简便的途径。本专利技术的第二个目的是为上述单克隆抗体介导的呋喃西林残留检测方法提供可方便操作的应用途径。一种是用于制作呋喃西林残留ELISA快速检测试剂盒。呋喃西林残留ELISA快速检测试剂盒包括 1)包被有合成抗原SEM-OVA的聚苯乙烯酶标板；2)浓缩稀释液；3)浓缩洗液；4)抗呋喃西林单克隆抗体；5)酶标抗体；6)底物缓冲液；7)底物；8)终止液。另一种是用于制作呋喃西林残留ELISA快速检测试纸条。呋喃西林残留ELISA快速检测试纸条的制作方法是1)胶体金标记抗体胶体金上标记纯化后的单克隆抗体；2)喷金将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；3)制作硝酸纤维素膜将试纸条中T线和C线喷到硝酸纤维素膜上；4)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装，然后切条。试剂盒或试纸条分别是单克隆抗体介导的呋喃西林残留检测方法的两种应用形式，可为人们快速检测提供方便。具体实施例方式(1)抗原合成首先，还原呋喃西林将氨基取代呋喃西林中的硝基，制成还原的呋喃西林溶液。抗原合成采用重氮化法进行偶联。取23mg亚硝酸钾溶于1ml蒸馏水中，以冰水浴调温度至0-5℃；还原好的呋喃西林溶液，37℃水浴作用20分钟，上清液冷却至4℃左右，调PH值1-2，再缓慢加入亚硝酸钾溶液并不断搅拌，静置反应30min；将100mg的牛血清白蛋白溶于4ml的磷酸盐缓冲液中，冷却至4℃左右，将重氮化药物缓慢加入并不断搅拌，为保持加入过程中PH的稳定，同时加入0.2mol/L NaOH，调PH值至7.4，4℃过夜反应；然后4℃PBS透析偶联后的产物72-96h，每6h换液一次，直至透析液中检测不出任何小分子物质；偶联后的产物以0.45μm滤膜过滤，-20℃分装保存。(2)动物免疫用合成的免疫抗原腹腔注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠。免疫程序如下首免和二免按抗原50μg/只剂量，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等体积混合(共0.3ml)免疫，免疫间隔期为10天，之后以100μg/只的剂量加强免疫，10天一次共免疫4次，融合前3天再追加免疫一次。(3)杂交瘤筛选方法的建立小鼠眼眶采血，分离血清后，将血清作1∶50和1∶100稀释。包被原SEM-OVA按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000稀释，之后倍比稀释至1∶64000。用方阵法建立非竞争性间接ELISA方法。ELISA反应程序如下①SEM-OVA用包被缓冲液稀释至适当浓度，每孔100ul，4℃包被过夜，以PBST洗涤3次，每次3min。②用5％脱脂乳满孔封闭，37℃孵育2h，洗涤同上。③将阳性血清稀释后顺序加入，每孔100ul，每一稀释度的阳性血清同时设阴性对照，37℃孵育1h，洗涤同上。④用稀释液将酶标二抗稀释到适当的工作浓度，每孔加100ul，37℃孵育1h，洗涤同上。⑤每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37℃孵育30min。⑥每孔加2N H2SO4的终止液50ul。⑦测定OD值，以空白孔调零，以测定孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，判为阳性。(4)细胞融合与筛选最后一次免疫后第3天，无菌操作取小鼠的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞融合。在45～60sec内加入1ml 50％的PEG 4000，随即加入大量无血清的DMEM中止反应，静置离心后，用HAT培养液重悬，加入适量的饲养细胞，混匀后铺种于5块96孔细胞培养板，于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞长至孔底的1/10或培养上清变黄时，用已建立的ELISA方法筛选。阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆，并选择优良稳定者建立细胞株。获得能稳定分泌抗SEM抗体的杂交瘤细胞株，代号为SEM-1F8E9。杂交瘤细胞株SEM-1F8E9已于2006年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No1790。(本文档来自技高网...
【技术保护点】
单克隆抗体介导的呋喃西林残留检测方法，其特征在于以抗呋喃西林单克隆抗体为介导建立呋喃西林残留ＥＬＩＳＡ快速检测方法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宝亮，余兵，陶宏锦，秦爱建，金文杰，沈崇钰，施伟良，李应国，王华全，陈忘名，刘宝荣，蒋原，丁涛，王倩倩，邵红霞，
申请(专利权)人：蔡宝亮，余兵，陶宏锦，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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