检测基因甲基化制造技术

本发明专利技术涉及检测基因甲基化。本发明专利技术提供了一种诊断增殖性疾病的存在或预测其过程的方法，包括使用选自Ｓｅｑ．ＩＤ．ＮＯ．１－３５和４４－５３的试剂，测定生物样本中标志物的甲基化状态。本发明专利技术还提供了一种用于实施上述方法的试剂盒，其中包括核酸扩增和检测试剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及探询甲基化基因的用途，例如用于细胞增殖性疾病(如癌症)的诊断和预后分析。相关的基因包括谷胱甘肽S-转移酶(GSTP1)基因或其部分。
技术介绍
在高等真核生物中，只在位于CpG二核苷酸的鸟苷5’的胞嘧啶上发生DNA甲基化。这种修饰对于基因表达具有重要的调控作用，特别是当涉及到位于基因启动子区的CpG丰富区域(CpG岛)。在永生化和转化细胞中，正常未甲基化CpG岛经常发生异常甲基化而且这种异常甲基化与某些肿瘤抑制基因或改善某些人类癌症相关的基因的转录失活有关。谷胱甘肽S-转移酶(GST)催化细胞内解毒反应，它通过催化谷胱甘肽与具有化学活性的亲电子基结合使亲电子致癌物失活(C.B.Pickett，等，Annu.Rev.Blocbern.，58743，1989；B.Coles，等，CRC Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，2547，1990；T.H.Rushmore，等，J.Biol.Chem.26811475，1993)。人GST由不同的基因座中某些不同的基因编码，分为α、μ、π和θ四个家族(B.Mannervik，等，Biochem.J.，282305，1992)。许多人类癌症如前列腺癌和肝癌表现为GSTP1表达水平相对于它们的源组织减少。在前列腺癌的情况下，具体地说，设计可区别良性前列腺增生和前列腺癌的甲基化特异性PCR(“MSP”)的引物和探针是很复杂的。如果研究者设定检测为100％特异性，所公开的最好的引物/探针组一般最高达到75％的灵敏度；而如果研究者设定检测为100％灵敏度，则其特异性不足60％。用新的引物和探针组合可以得到更稳定可靠的测定法。本专利技术就实现了这一需求。
技术实现思路
在本方明的一个方面中，用于检测受试者的前列腺组织或其它样本中的细胞增殖性疾病的方法，包括使扩增和检测某些基因的超甲基化区域中使用的试剂接触细胞成分。在本专利技术的另一方面中，至少一种所述的超甲基化基因是可联合一种或多种其它基因而测定的GSTP1。在本专利技术的另一方面中，怀疑含甲基化靶序列的核酸样本可从生物样本中获得，用引导部分靶序列的试剂来处理样本，扩增核酸靶，并且与已知正常样本比较扩增样本的甲基化程度。在本专利技术的另一方面中，对不太可能甲基化的序列进行了扩增和检测，以与扩增的甲基化序列进行比较。在另一方面中，本专利技术提供了用于检测细胞增殖性疾病的方法。这种方法通过扩增基因来完成，其中所述基因的甲基化状态是细胞增殖性疾病的指示物。检测方法可以包括用修饰未甲基化胞嘧啶的试剂接触含有核酸的样品或生物流体、用区别修饰的甲基化和未甲基化核酸的寡核苷酸引物或引导序列来扩增样品的核酸、以及根据扩增期间有无扩增产物来检测甲基化核酸。本专利技术的方法包括确定样本甲基化比率。甲基化比率是指在疾病状态下超甲基化的标志物(或标志物的区域)的甲基化水平相对于同样条件下未超甲基化的标志物的甲基化水平的比值(或者相对于同样条件下未超甲基化的相同标志物的区域)。当通过在疾病状态下超甲基化标志物的甲基化与另一个未超甲基化标志物的甲基化的比较来确定甲基化比率时，第二个标志物称为参照标志物。在本专利技术的另一方面中，通过定量实时PCR来确定甲基化比率。在本专利技术的另一方面中，提供了用于诊断和/或预后分析的报道分子。在另一个实施方案中，本专利技术提供了用于检测甲基化核酸的试剂盒。试剂盒包括一个或多个容器；第一个容器装有修饰未甲基化胞嘧啶的试剂，第二个容器装有引导扩增含CpG的核酸的试剂，其中该试剂可区分修饰的甲基化和未甲基化核酸。在本专利技术的另一方面中，用本专利技术的方法或试剂盒检测的核酸序列包括启动子或其部分。在本专利技术的另一方面中，用于检测某些基因的甲基化部分的方法和试剂盒包括鉴定另外核酸存在的步骤和/或组分。将目的甲基化基因受到处理(例如扩增)影响的程度与其它核酸进行比较，来确定标志物的甲基化程度。附图说明图1是利用现有技术的探针和引物进行MSPCR分析的结果图。图2是根据本专利技术用水解探针和引物进行MSPCR分析的结果图。具体实施例方式某些基因的超甲基化与前列腺癌发生相关。在本说明书中将含有所述基因或所述基因的部分的核酸序列称为标志物。标志物包括含以下所述的基因或基因的部分的核酸GSTP1(Seq.ID.No.54)、RARB2(Seq.ID.No.57)、RASSF1A(Seq.ID.No.64)、TIMP3(Seq.ID.No.58)、APC(启动子＝Seq.ID.No.59，基因＝Seq.ID.No.60)、β-肌动蛋白(Seq.ID.No.55和56)、PTGS2(启动子＝Seq.ID.No.61，基因＝Seq.ID.No.62)和14-3-3σ(Seq.ID.No.63)。检测所述超甲基化的鉴定法包括例如MSP和限制性内切酶分析的技术。启动子区是检测所述的超甲基化分析特别值得注意的靶。GSTP1的启动子区的序列分析表明，接近72％的核苷酸是CG，并且约10％的核苷酸是CpG二核苷酸。本专利技术提供了在受试者的组织或其它生物样本中确定标志物的某些区域的甲基化状态的方法，其中扩增和检测与增殖性疾病相关的DNA。由于特殊区域(如启动子)的超甲基化常导致标志物编码的蛋白质水平减少(即转录水平降低)，因此期望鉴定所述的区域是否发生超甲基化。在GSTP1基因情况中，这是最常见的。超甲基化区域是那些与正常组织比较，患病组织样本中甲基化达到了统计学上显著更高程度的区域。针对本专利技术的目的，使用特异于某些标志物区域的核酸探针或报道分子来检测生物流体或组织中标志物基因甲基化区域的存在。通过例如PCR的技术，基于标志物序列的某些部分的寡核苷酸引物特别适用于扩增DNA。可以使用含可检测量的相关多核苷酸的任何样品。本专利技术优选的样品为泌尿生殖源组织，特别是前列腺组织。样本优选包括上皮细胞。本专利技术一些引物/探针或报道分子试剂被用来检测标志物基因表达控制序列的甲基化。这些是调控核酸序列转录、有时也调控翻译的核酸序列。因而，表达控制序列可包括如下序列启动子、增强子、转录终止子、起始密码子(即ATG)、内含子剪接信号、可使mRNA准确翻译的维持正确基因读框的序列及终止密码子。GSTP1启动子是有用的标志物的典型表达控制序列。它是能指导基因转录产生谷胱甘肽S-转移酶蛋白的多核苷酸序列。启动子区位于结构基因上游或5′位。它包括足以使得启动子依赖型基因表达对于细胞类型特异性、组织特异性都是可控制的、或者对于外部信号或试剂是诱导的一些元件；所述的元件可位于多核苷酸序列的5′区或3′区。本专利技术的一种方法包括用结合核酸的试剂接触含标志物的靶细胞。靶细胞的成分为核酸，例如DNA或RNA。试剂包括探针和引物(如PCR或MSP引物)或被设计成用于扩增和检测靶序列的其它分子。例如，试剂可包括结合或键合它们自身报道分子片段的引导序列，如称为Scorpion试剂或Scorpion报道分子的试剂，参见Whitcombe等人的美国专利6,326,145和6,270,967(此处全部引用作为参考)所述。虽然它们描述不同，但用于本说明书中的“引物”和“引导序列”术语是指引导核酸序列扩增的分子或其部分。一种检测甲基化模式的敏感方法包括联合使用甲基化敏感酶与聚合酶链反应(PCR)。在DNA经过酶消化后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诊断增殖性疾病的存在或预测其过程的方法，包括使用选自Ｓｅｑ．ＩＤ．ＮＯ．１－３５和４４－５３的试剂，测定生物样本中标志物的甲基化状态。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T维纳，J梅罗特拉，S瓦德，A马祖德，J巴登，J巴库斯，
申请(专利权)人：维里德克斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]