枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法技术

本发明专利技术提供一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵的方法，涉及微生物发酵工程领域。该方法具体步骤包括：枯草芽孢杆菌摇瓶培养，接种到一级种子罐，温度30‑35℃，转速160～200rpm/min，pH为6.7～7.9条件下发酵培养18h，作为二级培养种子液接种到二级种子罐温度30～35℃，转速160～200rpm/min，pH为6.7～7.9条件下发酵培养36h，作为发酵种子液接种到发酵罐，温度30～35℃，转速160～200rpm/min，pH为6.7～7.9条件下发酵培养48h，得到枯草芽孢杆菌高密度发酵液。

【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法
本专利技术涉及微生物发酵工程领域，特涉及一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法。
技术介绍
芽孢杆菌作为土壤和植物微生态区系的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病的作用。许多性状优良的分离菌株已经成功应用于植物的病害生物防治领域。枯草杆菌通过定殖到植物根际、体表或体内，与病原菌竞争养分，并分泌抗菌物质的方式来抑制病原菌生长；同时诱导植物的防御系统起作用来抵御病原菌的入侵，从而达到生防的目的。CN201510118428.0利用纳米氧化铝使发酵液抗菌能力得到显著提升的提高海洋枯草芽孢杆菌发酵液抗菌能力的发酵方法，其特征在于该海洋枯草芽孢杆菌培养分为两个阶段发酵：第一阶段发酵促进菌体迅速生长，第二阶段发酵通过向第一阶段发酵得到的发酵液中添加纳米氧化铝来诱导海洋枯草芽孢杆菌，使其发酵液抗菌能力提高，与现有技术相比，可显著提高海洋枯草芽孢杆菌发酵液抗菌能力。CN201110051406.9公开了一种高芽孢率的枯草芽孢杆菌发酵方法，属于微生物发酵工程领域。该方法是经激活枯草芽孢杆菌、二步发酵培养生产目标产品。先接种激活的枯草芽孢杆菌，培养温度为35～38℃、罐压0.02～0.06Mpa、通气比例为1∶0.5～1∶1、搅拌转数为150rpm～200rpm，发酵培养8～14小时，得到种子菌液，再将种子菌液接种培养20～26小时，得到高芽孢率枯草芽孢杆菌液体产品。该方法所得的枯草芽孢杆菌活菌数高，并且芽孢率高，达到3.0×109CFU/ml以上，显著提高产品的芽孢数和产品质量。枯草芽孢杆菌发酵是一种复杂的过程，虽然枯草芽孢杆菌对营养需求并不是很苛刻，一般的培养基均可以生长良好，但是要实现高效的菌体浓度和高效的成孢率而不运用浓缩技术还是有些困难的，尤其是工业大规模生产更需要简单高效的生产工艺。现有技术通过第二阶段发酵通过向第一阶段发酵得到的发酵液中添加纳米氧化铝来诱导海洋枯草芽孢杆菌，使其发酵液抗菌能力提高，但存在纳米氧化铝容易结块团聚，效果不稳定，需要采用新的材料来更大程度的提高发酵液抗菌能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵的方法，该方法无需补料、无需浓缩，用该方法生产的枯草芽孢杆菌菌数多、成孢率高、工艺简单、生产周期短、经济实用，适用于枯草芽孢杆菌的工业化生产。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，包括如下步骤：（1）取枯草芽孢杆菌菌落接种摇瓶培养，制成摇瓶种子液；（2）在一级种子发酵培养罐中配制种子发酵培养基，其中所述一级种子发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；（3）将摇瓶种子液接种到一级发酵培养基中发酵培养，接种体积百分比为5～10%，发酵温度为30～35℃，一级种子发酵罐转速为150～200rpm/min，DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养16～18小时，得到一级发酵种子液；（4）在二级种子发酵罐中配制二级种子发酵培养基，其中所述二级种子发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；（5）将一级发酵种子液接入二级种子发酵培养基中，接种体积百分比为8～12%，第一阶段发酵结束后，向发酵液中添加抗菌增效剂，添加量为发酵液质量百分比含量2～7%，发酵温度为30～35℃，二级种子发酵罐转速为120～180rpm/min，DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养18～36小时，得到二级发酵种子液；（6）在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中所述液体发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；（7）将二级发酵种子液接入液体发酵培养基中，接种体积百分比为8～12%，发酵温度为30～35℃，液体发酵罐转速为80～160rpm/min，DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养36～48小时，得到枯草芽孢杆菌高密度发酵液。其中，一级种子发酵培养基、二级种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8～7.5。其中，一级种子发酵培养基、二级种子发酵培养基和液体发酵培养基均包括以下组分和组分含量：葡萄糖0.6～0.8%，糊精20～25%，玉米浆粉0.6～0.8%，酵母粉0.3～0.5%，CaCO31～2%，(NH4)2SO41～1.5%，MgSO40.3～0.5%，MnSO40.03～0.05%，消泡剂0.05～0.1%，其余为水。其中，葡萄糖、糊精、玉米浆粉、酵母粉、CaCO3、(NH4)2SO4、MgSO4、MnSO4的含量为质量百分比，消泡剂的含量为体积百分比。其中，步骤（2）包括：对一级种子发酵培养基进行高温灭菌，灭菌温度为121～125℃，压力为0.103～0.168MPa，灭菌25-45min,灭菌后的一级种子发酵培养基的pH值6.8～7.5。其中，步骤（4）包括：对二级种子发酵培养基进行高温灭菌，灭菌温度为121～125℃，压力为0.103～0.168MPa，灭菌25-45min，灭菌后的二级种子发酵培养基的pH值6.8～7.5。其中，步骤（6）包括：对液体发酵培养基进行高温灭菌，灭菌温度为121～125℃，压强为0.103～0.168MPa，灭菌25-45min，灭菌后的液体发酵培养基的pH值6.8～7.5。其中，步骤（1）包括：用灭菌的接种环蘸取枯草芽孢杆菌菌落，接入摇瓶中的LB液体培养基，29-33℃，150-200rpm/min，震荡培养5-10h，生长至OD6000.8～1.2，即为枯草芽孢杆菌种子液；其中，LB培养基的pH值为6.5～7.5，按重量份，所述LB液体培养基包括蛋白胨7-14份，酵母粉8-15份，氯化钠4-8份，水0.8-1.8份。所述抗菌增效剂采用辛烯基琥珀酸淀粉钠作为原料；所述抗菌增效剂采用含氢硅油与辛烯基琥珀酸淀粉钠发生硅氢加成反应；所述抗菌增效剂的制备方法为：按重量份，将11-18份羧基化多壁碳纳米管分散到100-200份的含氢硅油，再加入30-50份质量百分比浓度5-10%的辛烯基琥珀酸淀粉钠水溶液，0.01-0.1份铂碳催化剂，加热至70-80℃，搅拌反应100-200min继续搅拌反应20-50min，冷却至常温，过滤，水洗，干燥即可得到一种抗菌增效剂。其反应机理为：羧基化多壁碳纳米管具有较大的比表面积，含氢硅油与辛烯基琥珀酸淀粉钠发生硅氢加成反应，可以吸附在羧基化多壁碳纳米管的骨架上，使抗菌增效剂与发酵液相容性提高，有利于羧基化多壁碳纳米管与发酵液的反应接触面积提高，相对于无机纳米材料，本专利技术抗菌增效剂诱导枯草芽孢杆菌产生更多的抗菌物质，可显著提高发酵液的抗菌能力。含氢硅油又名聚甲基氢硅氧烷，CAS号63148-57-2。本专利技术的有益效果：本专利技术采用葡萄糖、糊精、玉米浆粉、酵母粉、CaCO3、(NH4)2SO4、MgSO4、MnSO4等按照合适的配比制成培养基，可使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一，取枯草芽孢杆菌菌落接种摇瓶培养，制成摇瓶种子液；/n步骤二，在一级种子发酵培养罐中配制种子发酵培养基，其中所述一级种子发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；/n步骤三，将摇瓶种子液接种到一级发酵培养基中发酵培养，接种体积百分比为5～10%，发酵温度为30～35℃，一级种子发酵罐转速为150～200rpm/min, DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养16～18小时，得到一级发酵种子液；/n步骤四，在二级种子发酵罐中配制二级种子发酵培养基，其中所述二级种子发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；/n步骤五，将一级发酵种子液接入二级种子发酵培养基中，接种体积百分比为8～12%，第一阶段发酵结束后，向发酵液中添加抗菌增效剂，添加量为发酵液质量百分比含量2～7%，发酵温度为30～35℃，二级种子发酵罐转速为120～180rpm/min，DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养18～36小时，得到二级发酵种子液；/n步骤六，在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中所述液体发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；/n步骤七，将二级发酵种子液接入液体发酵培养基中，接种体积百分比为8～12%，发酵温度为30～35℃，液体发酵罐转速为80～160rpm/min，DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养36～48小时，得到枯草芽孢杆菌高密度发酵液；/n其中，一级种子发酵培养基、二级种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8～7.5。/n...

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，取枯草芽孢杆菌菌落接种摇瓶培养，制成摇瓶种子液；
步骤二，在一级种子发酵培养罐中配制种子发酵培养基，其中所述一级种子发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；
步骤三，将摇瓶种子液接种到一级发酵培养基中发酵培养，接种体积百分比为5～10%，发酵温度为30～35℃，一级种子发酵罐转速为150～200rpm/min,DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养16～18小时，得到一级发酵种子液；
步骤四，在二级种子发酵罐中配制二级种子发酵培养基，其中所述二级种子发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；
步骤五，将一级发酵种子液接入二级种子发酵培养基中，接种体积百分比为8～12%，第一阶段发酵结束后，向发酵液中添加抗菌增效剂，添加量为发酵液质量百分比含量2～7%，发酵温度为30～35℃，二级种子发酵罐转速为120～180rpm/min，DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养18～36小时，得到二级发酵种子液；
步骤六，在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中所述液体发酵培养基的初始pH值是6.7～7.9；
步骤七，将二级发酵种子液接入液体发酵培养基中，接种体积百分比为8～12%，发酵温度为30～35℃，液体发酵罐转速为80～160rpm/min，DO值为30～60%，罐压为0.02～0.08Mpa，培养36～48小时，得到枯草芽孢杆菌高密度发酵液；
其中，一级种子发酵培养基、二级种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8～7.5。


2.如权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，
所述一级种子发酵培养基、二级种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8～7.5。


3.如权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，
所述一级种子发酵培养基、二级种子发酵培养基和液体发酵培养基均包括以下组分和组分含量：葡萄糖0.6～0.8%，糊精20～25%，玉米浆粉0.6～0.8%，酵母粉0.3～0.5%，CaCO31～2%，(NH4)2SO41～1.5%，MgSO40.3～0.5%，MnSO40.03～0.05%，消泡剂0.05～0.1%，其余为水；
其中，葡萄糖、糊精、玉米浆粉、酵母粉、CaCO3、(NH4)2SO4、MgSO4、MnSO4的含量为质量百分比，消泡剂的含量为体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐琳琳，郑秋玲，李成强，郭琳，唐美玲，王建萍，肖慧琳，徐维华，沙玉芬，刘万好，
申请(专利权)人：烟台水禾土生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37