乙型肝炎病毒的检测方法技术

本发明专利技术提供血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）抗原的检测或定量方法，以及非常简便有效地处理上述检测和定量测定所用样本的方法。含有乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的样本的处理方法的特征在于：用处理剂对含有ＨＢＶ的样本进行处理，从而释放ＨＢＶ抗原并破坏与ＨＢＶ抗原结合的抗体，所述处理剂包括：（１）酸化剂，（２）蛋白质变性剂、分子中有烷基和叔胺或季铵盐的两性表面活性剂、或阳离子表面活性剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及处理含有乙型肝炎病毒(下文中称为“HBV”)的样本以便高灵敏度地检测或定量测定血液中的HBV抗原的方法，以及应用所述处理方法检测或定量测定HBV抗原的方法。
技术介绍
HBV是最早确定为通过手术中输血引起输血后肝炎和HBV感染的病原病毒。因此，为了筛选输血用血液，诊断血液是否受到HBV感染是极其重要的。 这种HBV感染的诊断方法有样本中抗HBV抗体的检测方法、HBV抗原的检测方法或HBV基因的检测方法。 在这些方法中，HBV基因检测方法包括核酸扩增法(NAT)和DNA探针检测法，目前临床上广泛采用这些方法。此外，由于NAT法应用的普及，HBV DNA的量与HBV携带者病态间的关系受到关注，NAT法已普遍用于抗病毒药物治疗后的监控中。 PCR法和TMA法等NAT法是基因片段的高灵敏度检测方法。然而，当从样本中提取HBV基因组DNA时，这些方法过于复杂，在手工操作时需要的处理时间长达2小时，而且还包括多个操作步骤，等等。另外，这一操作的复杂性增加了受污染的机会，并且还增加了产生假阳性样本的可能性。还有一个问题是需要熟练的技巧才能获到稳定的测量值。虽然近年来自动化仪器的研发采取了针对污染的措施，缩短了提取DNA的操作时间，但是仍需要十分昂贵的仪器，因此除大量样本需要在研究机构处理外，并没有普及使用。另外，因为DNA引物必须与目标基因一致，所以需要使用多种引物，这就产生了每次测试成本都比免疫测定法成本高的问题。 因为这些与HBV基因组检测法有关的问题，所以病毒抗原检测方法受到关注。在HBV抗原检测方法中，HBs抗原的检测法已成为血液筛选的常规方法，HBe抗原的检测法也广泛用于HBV增殖标记。 除了这些抗原检测法外，已开发出HBV核心抗原(HBc抗原)的直接检测法。Usuda等(Journal of Virological Methods，72，95-103，1998)开发出一种用具有HBV核心(HBc)抗原特异性的单克隆抗体检测血清HBc抗原的方法，并指出该方法与上述用于病毒基因组检测的NAT法有同样的临床效果。这一HBc抗原检测系统因为扩增程序不包括在检测过程中，所以比较耐污染。 然而，即使用上述方法，仍会留下一些问题。用于测定的样本处理程序又复杂又耗时，如果将该方法用于筛选、监控等用途时就会出现问题。为了浓缩病毒颗粒并除去血清成分，处理样本(血清)时，包括用抗HBs多克隆抗体进行处理(37℃，2小时)、离心(10分钟)、除去上清液、用表面活性剂处理、用碱处理(35分钟)、添加中和剂等多个步骤的处理过程是必需的。因为这些步骤要求非常熟练的操作，所以必需有一定的熟练程度才能获得再现性。另外，处理时间最低大约需要3小时。而且，因为包括离心和除去上清液等步骤，所以自动化操作有困难，同时大量处理也有困难；因此就操作程序而言，上述方法不适于需要大量处理的应用。 另外，Oshihara等开发出一种无需使用抗HBs多克隆抗体进行处理，而是通过用碱处理、用链霉蛋白酶处理和添加非离子表面活性剂乙基苯基聚乙二醇P40(Nonidet P40，NP-40)和巯基乙醇测定HBc抗原的方法(日本专利特开平第8-50133号)。然而，这一方法的灵敏度低，检出限的HBc抗原浓度相当于2.2pg/ml的HBV-DNA浓度，该HBV-DNA的浓度估计为105～106拷贝/ml。 除了上述HBc抗原的检测方法外，还开发出允许同时测定HBe抗原和HBc抗原的HBV核心关连抗原(HBcr抗原)的测定方法(国际公布WO 02/14871 A1)和形成HBV病毒样颗粒的HBV p22cr抗原(HBV p22cr抗原)的测定方法(国际公布WO 04/22585 A1)。这些方法比HBc抗原检测法更灵敏，但是与HBV基因组测定法相比，灵敏度仍不能令人满意。 专利文件1日本专利特开平第8-50133号。 专利文件2国际公布WO 02/14871 A1。 专利文件3国际公布WO 04/22585 A1。 非专利文件1Journal of Virological Methods，72，95-103，1998。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题免疫测定法操作简便，成本低。但是，HBe抗原用作增殖标记的现有测定法不能测定在抗HBe抗体存在时免疫复合物中存在的HBe抗原。另外，尽管HBc抗原的量与HBV DNA的量有关，但是因为上述预处理的复杂性和灵敏度不够，所以HBc抗原测定法不适用于临床研究。 另一方面，在HBV核心关连抗原测定和HBV p22cr抗原测定时，用表面活性剂和加热(56℃～70℃)对样本进行预处理，以破坏抗体和病毒颗粒，然后测定HBV核心关连抗原或HBV p22cr抗原。 然而，这些方法也需要换地方(off-board)处理样本，完全自动化的应用颇为困难。 因此，本专利技术的目的是为筛选乙型肝炎、监控慢性乙型肝炎患者的治疗等，提供即使在抗HBV抗体存在时，检测HBV核心关连抗原(HBe和HBc抗原)、HBV p22cr抗原等的预处理方法及应用该预处理方法进行测定的方法。换句话说，本专利技术的目的是提供检测HBV抗原的系统，该系统能够在较短时间内通过简便的预处理，方便地应用到自动化系统等大量处理系统中。 解决问题的手段作为深入研究解决上述问题的结果，本专利技术的专利技术人关注的是(a)含有HBV的样本的处理方法，该方法仅仅通过短时间内的简单操作，就可使样本中的HBV抗原转化成适于用探针检测的状态，(b)检测样本中的HBV抗原的处理方法，该方法通过短时间内的简单操作，使来源于宿主的抗HBV抗原的抗体与捕捉或检测探针竞争，同时使之失活。另外，本专利技术的专利技术人发现，对于HBV抗原测定，样本中存在的HBV抗原不仅可从病毒颗粒或免疫复合物释放出来，而且样本中存在的抗HBV抗原的人抗体还可用以下方法使之失活(c)样本用酸化剂处理，(d)除了前述处理外，还用表面活性剂、蛋白质变性剂和还原剂处理，(e)使用该处理方法后，可提供最适于用抗体等探针进行免疫测定的样本。而且，本专利技术的专利技术人发现可以提供(f)一种用处理剂处理样本的步骤，该步骤会释放含有来自病毒颗粒的HBV抗原样本中存在的HBV抗原，同时还使样本中存在的抗HBV的人抗体失活；一种通过包括处理步骤的免疫测定，检测和定量测定HBV抗原的方法，(g)含有处理剂的HBV抗原测定试剂盒，专利技术人基于这些发现完成了本专利技术。 因此，本专利技术提供下述第1～3项1.一种含有HBV的样本的处理方法，其特征在于用处理剂对含有HBV的样本进行处理，以释放HBV抗原，并使与HBV抗原结合的抗体失活，所述处理剂包括(1)酸化剂，和(2)表面活性剂和/或蛋白质变性剂。 2.一种HBV抗原的免疫学检测方法，所述方法包括(1)前述第1项的含有HBV的样本的处理方法的实施步骤，和(2)使用与HBV抗原结合的探针检测HBV抗原的步骤。 3.一种诊断试剂或诊断试剂盒，所述试剂或试剂盒在用于处理样本以检测HBV抗原的处理剂中包括以下所述的酸化剂(1)和至少一种选自(2)的物质(1)酸化剂；和(2)同一分子中有烷基和叔胺或季铵盐的两性表面活性剂、同一分子中有烷基和叔胺或季铵盐的阳离子表面活性剂、非离子表面活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其特征在于用处理剂对含有乙型肝炎病毒的样本进行处理，以释放乙型肝炎病毒抗原，并使与乙型肝炎病毒抗原结合的抗体失活，所述处理剂包括：　　　　（１）酸化剂，和　　　　（２）表面活性剂和／或蛋白质变性剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2004-5-19 149682/20041.一种含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其特征在于用处理剂对含有乙型肝炎病毒的样本进行处理，以释放乙型肝炎病毒抗原，并使与乙型肝炎病毒抗原结合的抗体失活，所述处理剂包括(1)酸化剂，和(2)表面活性剂和/或蛋白质变性剂。2.权利要求1的含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其中还向所述表面活性剂和/或蛋白质变性剂中加入还原剂。3.权利要求1或2的含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其中所述表面活性剂是至少一种选自以下的表面活性剂同一分子中有烷基和叔胺或季铵盐的两性表面活性剂、同一分子中有烷基和叔胺或季铵盐的阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂。4.权利要求3的含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其中所述表面活性剂的烷基碳原子数是12个以上。5.权利要求1的含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其中所述酸化剂是盐酸、硫酸、乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸。6.权利要求4的含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其中所述同一分子中有12个以上碳原子的烷基和叔胺或季铵盐的两性表面活性剂是N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐或N-十八烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐。7.权利要求4的含有乙型肝炎病毒的样本的处理方法，其中所述分子中有12个以上碳原子的烷基和叔胺或季...

【专利技术属性】
技术研发人员：大植千春，槇升，木村达治，
申请(专利权)人：株式会社先端生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]