本发明专利技术涉及一种双脂膜表面改性的蛋白质芯片，其以硅基片为固体基片，其上依次为与硅基片共价键结合的Ｌ－α－磷脂酰乙醇胺单分子层，和与该磷脂酰乙醇胺单分子层通过疏水作用结合的对硝基苯酯基－聚乙二醇－（１，２－双油酰基－３－甘油磷脂乙醇胺）层。该蛋白质芯片是在微流道系统中将Ｌ－α－磷脂酰乙醇胺单分子层共价固定到硅基片表面，然后吸附对硝基苯酯基－聚乙二醇－（１，２－双油酰基－３－甘油磷脂乙醇胺）得到的。该蛋白质芯片可以用于椭偏成像生物传感器，通过在该蛋白质芯片表面ＰＥＧ的末端官能基来共价固定配基分子，探测能与其特异性结合的靶分子，二者结合后，在椭偏成像系统中可以观察到蛋白质芯片表面形貌变化。本发明专利技术的双脂膜表面改性的蛋白质芯片可以有效阻止非特异性吸附，其配基分子层具有很好的稳定性，且保持高生物活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种双脂膜表面改性的蛋白质芯片，其制备方法，以及该蛋白质芯片在椭偏成像生物传感器中应用。
技术介绍
随着蛋白质芯片传感技术被广泛应用到越来越多的领域，一些亟需解决的问题也暴露出来。常用的蛋白质芯片是将蛋白质分子固定到固体基片表面上作为配基，用以识别与之发生特异性结合的生物分子。蛋白质分子作为配基固定在芯片的表面上是有一定的密度的，并且分子间有间隙，这样的蛋白质芯片的表面接触到待测分子溶液时，待测分子与配基分子发生特异性结合产生特异信号的同时，也可以结合到配基分子间隙的芯片基底上而产生非特异信号。为了避免非特异信号，往往在配基分子装配后，用封闭液对芯片表面进行封闭。由于封闭液很难完全封闭配基分子间的全部芯片表面，因此很难避免非特异性吸附。在固体基片表面上固定配基分子的方法主要有物理吸附和共价连接，这两种方式均有缺陷。物理吸附方式是通过静电、疏水和氢键等相互作用将配基分子固定到固体基片表面上，不仅使蛋白质分子空间构像容易发生变化，导致生物活性降低；还容易使其在流动液体的环境下发生脱落，或是被其它蛋白质分子竞争吸附而替换下来。共价连接方式固定的配基分子相对比较稳定，可以部分解决物理吸附方法存在的蛋白质分子不稳定问题。但是，在蛋白质芯片表面上用于共价固定蛋白质分子的基团多为极性基团，这会增强蛋白质分子与固体基片表面间静电相互作用，从而使蛋白质分子空间构像发生改变，蛋白质分子生物活性降低的问题仍然存在。基于上述的现有技术很难避免非特异性吸附，而且在芯片基底上固定配基分子后其稳定性和生物活性降低的问题，需要研究一种新的蛋白质芯片，使得其在进行蛋白质检测时能够提高精确度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有蛋白质芯片技术中固定配基分子方法所存在的非特异性吸附、稳定性差和生物活性降低等缺陷，从而提供一种可以在保持配基分子生物活性情况下，将其稳定地固定在基片表面，同时还能够有效地抑制非特异性吸附的双脂膜表面改性的蛋白质芯片。本专利技术的另一目的在于提供上述双脂膜表面改性的蛋白质芯片的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述双脂膜表面改性的蛋白质芯片在用椭偏光学成像系统检测的生物传感器中的应用。本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的本专利技术提供一种双脂膜表面改性的蛋白质芯片，其以硅基片为固体基片，其上依次为与硅基片共价键结合的的L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-phosphatidylethanolamine，以下简称PE)单分子层，和与该磷脂酰乙醇胺单分子层通过疏水作用结合的对硝基苯酯基-聚乙二醇-(1，2-双油酰基-3-甘油磷脂乙醇胺)(p-nitrophenoxycarbonyl-PEG-1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，以下简称pNP-PEG-DOPE)的分子膜层。本专利技术提供一种上述双脂膜表面改性的蛋白质芯片的制备方法，如图1所示，其在微流道系统中将L-α-磷脂酰乙醇胺单分子层共价固定到硅基片表面，然后吸附PEG化的磷脂分子(对硝基苯酯基-聚乙二醇-(1，2-双油酰基-3-甘油磷脂乙醇胺))得到双脂膜层，具体步骤包括1)将硅基片裁成10×20mm2小片，放入30wt％H2O2和浓硫酸(体积比1∶3)混合溶液中浸泡30分钟，使基片羟基化，依次用水和乙醇清洗；将羟基化基片吹干后，放入5wt％3-氨丙基-3乙氧基硅烷和95wt％无水乙醇的混合溶液中，室温反应2小时，形成一层末端为氨基的单分子自组装膜，依次用乙醇和水清洗3次；最后，用含有2.5wt％戊二醛的PBS溶液浸泡1小时，用PBS缓冲液清洗，得到表面形成活性醛基的基片；2)在中国专利03102659.1中公开的用于制备生物芯片的微流道体系中，将步骤1)表面形成活性醛基的基片与微列阵模板紧密接触，并通过外力压紧；把L-α-磷脂酰乙醇胺溶液通过微流道微细管子输送到基片上选定区域，30分钟后，L-α-磷脂酰乙醇胺的胺基与基片上的醛基形成亚胺，在基片表面形成磷脂酰乙醇胺单分子层；然后通过微流道将PBS缓冲液输送到基片不同区域，将没有被固定在基片上的L-α-磷脂酰乙醇胺分子清洗掉； 所述的L-α-磷脂酰乙醇胺溶液是按照每毫升PBS缓冲液(pH 7.2)加入10mgL-α-磷脂酰乙醇胺和1wt％Tween 20的比例配制而成的；3)把PEG化的磷脂分子溶液通过微流道微细管子输送到固定了L-α-磷脂酰乙醇胺的基片上，30分钟后，由于疏水作用PEG化的磷脂分子与基片上L-α-磷脂酰乙醇胺单分子层形成双脂膜层；然后通过微流道微细管子将水输送到基片上，冲去缓冲液，将微列阵模板从基片上取下，即得到本专利技术的双脂膜表面改性蛋白质芯片；所述的PEG化的磷脂分子溶液是按每毫升乙酸钠缓冲液(pH4.0)加入5mg对硝基苯醋基-聚乙二醇-(1，2-双油酰基-3-甘油磷脂乙醇胺)比例配制而成的。本专利技术提供的上述双脂膜表面改性的蛋白质芯片可以用于椭偏成像生物传感器。通过在该蛋白质芯片表面PEG末端官能基团 来共价固定配基分子，探测能与其特异性结合的靶分子，二者结合后，在椭偏光学成像系统中可以观察到蛋白质芯片表面形貌变化。对本专利技术的双脂膜表面改性的蛋白质芯片的稳定性进行考察。分别使用2M氯化钠溶液，1wt％ Tween 20的PBS缓冲液(pH7.2)，10mM碳酸钠溶液和100mM盐酸溶液以20μl/min流速冲洗该双脂膜表面改性蛋白质芯片5分钟，在椭偏成像系统下观察，蛋白质芯片形貌没有发生改变，厚度没有变化。使用PBS缓冲液以20μl/min流速冲洗2小时，在椭偏成像系统下观察，蛋白质芯片形貌仍保持完整。将蛋白质芯片在氮气流中干燥，无尘储存1个月后，用水重新水化，在椭偏成像系统下观察，蛋白质芯片仍然是均匀的，厚度没有发生改变。将蛋白质芯片进行多次干燥-水化循环处理，在椭偏成像系统下观察，双脂膜仍能保持形貌完整，这些结果说明，本专利技术中的蛋白质芯片上的双脂膜是稳定的。综上所述，与现有技术相比，本专利技术提供的双脂膜表面改性蛋白质芯片优点在于1、该双脂膜表面改性蛋白质芯片上固定的磷脂双分子层具有很高的蛋白质选择性，有效地阻止了蛋白质的非特异性吸附，此外该双脂膜改性装配的配基分子层具有很好的稳定性。2、由于本专利技术使用的PEG是一类惰性水溶性高分子，可以有效地抑制非特异性吸附；另一方面，PEG长链作为连接臂，可以增加配基在溶液中的灵活性，减少空间阻碍，固定后的配基分子保持高生物活性。附图说明图1是本专利技术的双脂膜表面改性蛋白质芯片的制备方法的示意图；图2是实施例2中经双脂膜表面改性后的蛋白质芯片表面在椭偏光学显微成像系统中观察到下述单元的灰度图(A)和相应的厚度分布图(B)；图3是实施例3中在椭偏光学显微成像系统中观察到下述单元的灰度图(A)和相应的厚度分布图(B)；其中，单元1双脂膜层；单元2结合IgG分子的双脂膜层；单元3结合IgG、anti-IgG分子的双脂膜层；单元4直接结合在醛基基片表面上的IgG膜层；单元5直接结合在醛基表面上的IgG结合的anti-IgG膜层。具体实施例方式实施例1、制备PEG化的磷脂——对硝基苯酯基-聚乙二醇-(1，2-双油酰基-3-甘油磷脂酰乙醇胺)根据参考文献p-Nitrophenylcarbonyl-P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双脂膜表面改性的蛋白质芯片，其以硅基片为固体基片，其上依次为与硅基片共价键结合的磷脂酰乙醇胺单分子层，和与该磷脂酰乙醇胺单分子层通过疏水作用结合的ＰＥＧ化磷脂层。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：靳刚，王战会，梁伟，刘妍，
申请(专利权)人：中国科学院力学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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