本发明专利技术属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可同时测定人血浆中磷苯妥英、苯妥英及其主要代谢产物４′－羟苯妥英浓度的方法。本发明专利技术方法对待测样品经预处理后，待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用紫外检测器检测。本发明专利技术方法样品取样少，操作简便，快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，适合临床常规监测，对用以调整给药剂量，保证用药安全并有效，具有重要临床实践意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测 定人血浆中磷苯妥英、苯妥英及其代谢产物4'-羟苯妥英的方法。
技术介绍
苯妥英(phenytoin,PHT)是治疗急性癫痫发作或癫痫持续状态的高效药物。 因其水溶性差、和碱性强，使其使用价值受到影响。新近研究开发的非胃肠道给 药的抗癫痫药物(antiepileptic drugs, AEDs)磷苯妥英(fosphenytoin, FOS)是 PHT的磷酸酯前药。由于其高极性和适宜的pH，可以通过静脉滴注或肌肉注射 给药。FOS本身没有明显的药理活性，给药后经血液和组织中的磷酸酯酶代谢为 苯妥英后发挥抗癫痫作用。苯妥英主要通过4'-羟化代谢成4'-羟苯妥英 (4'-hydroxyphenytoin,4'-HPPH)，进而生成葡萄糖醛酸化物排出体外。FOS对免 疫学方法测定PHT有干扰，常使PHT测定值高于实际浓度。目前国内外尚未见 关于同时测定人血浆中FOS、 PHT和4'-HPPH的浓度的相关报道。因此研究开 发高效、灵敏、准确的检测血浆中上述药物浓度的方法，对用以调整给药剂量， 保证用药安全、有效具有重要临实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种简便、快速、灵敏、可同 时测定体内磷苯妥英(fosphenytoin，FOS)、苯妥英(phenytoin， PHT)和4'-羟苯 妥英(4'-hydroxyphenytoin, 4'-HPPH)血药浓度的方法。本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本 低等优点，适合常规血药浓度监测。本方法的技术方案是待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用 紫外检测器检测。包括下述步骤1) 样品预处理取待测样品，经磷酸酸化后，加入定量的有机溶媒进行萃取、离心后， 取上层有机层溶液氮气吹干、流动相复溶，取上清液进样；所述的磷酸酸化溶液为20 -40 %磷酸溶液，所述的有机溶媒为乙酸乙 酯溶液；2) 样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为Agilent RX-C8，高效液相系统采用 通用型紫外检测器以i:高压泵，流动相为酸性，等度洗脱；所述的流动相采用0.08 0.1Q/。三氟乙酸(TFA)水溶液(pH=2.1~2.5)、乙 腈和甲醇的混合液；所述的等度洗脱模式优选0.08~0.1% TFA水溶液乙腈甲醇为 60:17:23，V/V/V;3) 样品检测采用通用型紫外检测器检测FOS、 PHT和4'-HPPH的峰面积，紫外检测波长 为210士lnm，用标准曲线方程换算成浓度。本方法具有以下优点1. 采样量少测定一份样品只需O.lml血浆样本；2. 预处理简便 一步乙酸乙酯萃取，简便易行，适用于常规检测；3. 选择性强内源性物质、常用抗癫痫药物和非处方药物对测定不干扰；4. 测定时间短整个色谱分析测定过程仅为12min。所述FOS、 PHT和4'-HPPH测定的线性范围分别为1~400、 0.5~50和0.5~10 mg七-1，方法回收率均在100±12%，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD) 均小于11 %。本专利技术方法快速准确、操作简便、成本低，适合临床常规监测，对用以调整 给药剂量，保证用药安全并有效，具有重要临实践意义。 附图说明图l:空白血浆色谱图图2:静脉注射磷苯妥英18mg^g受试者0.5h的色谱图，其中，1: 4'-羟苯妥英(浓度为2.87mg'L"); 2:磷苯妥英(浓度为44.8mg.L");3:内标(盐酸普萘洛尔)；4:苯妥英(浓度为16.2 mgl")。图3:静脉注射磷苯妥英16mg/kg受试者0.5h的色谱图，其中，1: 4'-羟苯妥英(浓度为3.23mg七")；2:磷苯妥英(浓度为39.8mg丄");3:内标(盐酸普萘洛尔)；4:苯妥英(浓度为18.7 mg丄—1)。具体实施例方式实施例1:色谱条件HPLC系统色谱柱Agilent RX-C8 (250 mm x 4.6 mm， 5 |im)，流动相采 用0.08Q/oTFA水溶液-乙腈-甲醇(60:17:23，V/V/V)，流速1.5mL'min";柱温 40 。C;紫外检测波长210±lnm。血浆样品预处理精密吸取血桨样品100置1.5 mL离心管中，加入50 ^L20。/。磷酸酸化， 涡旋0.5min，加入lmL含10mg'L"盐酸普萘洛尔的乙酸乙酯溶液萃取，涡旋 5 min，离心(15, 000 xg， 4 °C) 10 min,取上层提取液800 ^L，转移到5 mL离 心管中，置于4(TC水浴中，氮气吹干，加入流动相100pL，取上清液20pL进 样分析，内标法以峰面积定量。专属性取不同来源的10名未服用磷苯妥英、苯妥英和4'-羟苯妥英的受试者的空白 血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述 测定组分有干扰，(见图1)。此外，常见合并用药丙戊酸、苯巴比妥、卡马西平、 多虑平、硝基安定、安定、氯硝安定、氟哌啶醇、甲硝唑、对乙酰氨基酚、硝苯 地平、布洛芬、阿昔洛韦等对测定没有干扰。内标普萘洛尔、磷苯妥英、苯妥英 和4'-羟苯妥英的典型色谱保留时间分别为9.1、 5.4、 10.7禾t] 4.6min，峰形良好， 分离完全。整个色谱分析过程时间为12min。线性试验精密称取FOS、 PHT和4'-HPPH标准物质适量，用50%甲醇溶解，稀释成 系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含FOS 1， 10， 100， 200， 300、 400mg-I/1， PHT0.5， 2.5， 12.5， 25， 37.5， 50 mg-I/禾卩4'-HPPH 0.5， 1.25， 2.5， 5.0， 7.5， 10.0mg丄"的标准血样。取血浆100 ^L，按"血浆样品预处理"方法 操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比C4)和待测组分浓度(C)作加权 -(1/Q线性回归，FOS、 PHT和4'-HPPH线性范围分别为1~400、 0.5-50和0.5~10 mg'I/1， FOS、 PHT和4'-HPPT的最低定量限为1.0、 0.5和0.5 mg'I/1，三者的 标准曲线回归方程分别为FOS^=0.02241 C-0.01326，产0.9991; PHTJ-0.03397 C-0.002 98， r=0.9994; HPPT ^=0.04400 C+0.00083， r=0.9992。准确度和精密度精密称取FOS、 PHT和4'-HPPH标准物质适量，50%甲醇溶解并稀释成系 列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含FOS2.5， 180， 360mg.U1， PHT1， 20， 40mg.L"和4'-HPPT1.0， 4.0， 8.0 mg'I/1的系列血样，各取血浆100nL，按 "血浆样品预处理"方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回 归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)， 其中(C实,C理论)/C理论xi00。/。为偏差，标准差/平均值xlOO。/。为相对标准差。结 果表明，三种待测物的日内和日间精密度均小于11.6%，偏差小于10.8%。表l显示了FOS、 PHT和4'-H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定人血浆中苯妥英及其前体药物和代谢物的方法，其特征是待测样品预处理后，经色谱柱分离后，用紫外检测器检测，包括以下步骤：１）样品预处理取待测样品，经磷酸酸化后，加入定量的有机溶媒进行萃取、离心后，取上层有机层溶液氮气吹干 、流动相复溶，取上清液进样；所述的磷酸酸化溶液为２０～－４０％磷酸溶液，所述的有机溶媒为乙酸乙酯溶液；２）样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为ＡｇｉｌｅｎｔＲＸ－Ｃ↓［８］，高效液相系统采用通用型紫外检测器以 及高压泵，流动相为酸性，等度洗脱；所述的流动相采用０．０８～０．１％三氟乙酸（ＴＦＡ）水溶液ｐＨ＝２．１～２．５、乙腈和甲醇的混合液；所述的等度洗脱模式为０．０８～０．１％ＴＦＡ水溶液∶乙腈∶甲醇为６０∶１７∶２３，Ｖ／Ｖ／ Ｖ；３）样品检测采用通用型紫外检测器检测苯妥英及其前体药物和代谢物的峰面积，紫外检测波长为２１０±１ｎｍ，用标准曲线方程换算成浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马春来，焦正，赵倩华，洪震，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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