敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肝癌对瑞戈非尼耐药药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤治疗领域，具体涉及敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肝癌对瑞戈非尼耐药药物中的用途。本发明专利技术公开了敲减SphK2的小干扰RNA能够逆转肝癌细胞对瑞戈非尼的耐药性。本发明专利技术中我们在耐药细胞株上发现用小干扰RNA敲减SphK2之后，耐药细胞株对瑞戈非尼的敏感性显著提高。而过表达SphK2之后，耐药细胞株对瑞戈非尼的敏感性显著降低。这些结果显示，抑制SphK2蛋白的表达量或者活性都能够有效的提高肝癌细胞对瑞戈非尼的敏感性，从而能够解决肝癌细胞对瑞戈非尼的耐药问题。本发明专利技术采用小干扰RNA敲减SphK2的方法降低的SphK2表达量，进而达到逆转肝癌对瑞戈非尼的耐药。

【技术实现步骤摘要】
敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肝癌对瑞戈非尼耐药药物中的应用
本专利技术涉及肿瘤治疗尤其是肿瘤耐药的逆转治疗领域，具体来说是指敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肝癌对瑞戈非尼耐药药物中的应用。
技术介绍
肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是威胁我国人民生命和健康的重大疾病，瑞戈非尼(Regorafenib)是治疗中晚期HCC的标准二线药物，能够在一线药物索拉非尼(Sorafenib)治疗失败后继续生效，体内外研究中均展现出良好的抗HCC效果。然而获得性耐药的发生不仅限制了HCC患者从瑞戈非尼治疗中长久获益，还使疾病恶化，病程加速；且更为严重的是，患者对瑞戈非尼耐药后尚无其他可选药物。因此寻找可能的逆转HCC瑞戈非尼获得性耐药的潜在药物具有非常重要的临床意义。目前针对HCC瑞戈非尼获得性耐药问题的研究非常少，至今还未有成熟的解决方案。公开报道的在体内外具有确切的逆转HCC瑞戈非尼获得性耐药的潜在药物也几乎没有。近年来肿瘤中的异常鞘磷脂代谢受到广泛关注，鞘氨醇激酶2(sphingosinekinase，SphK2)通过催化鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)的生成在鞘磷脂代谢中发挥关键作用。研究显示SphK2由于存在BH3类似结构域，能够诱导多种细胞凋亡并抑制细胞增殖；后来的部分研究认为SphK2通过其具有促癌作用的催化产物S1P促进肿瘤的发生发展。然而，目前为止SphK2在肝癌的发生发展和耐药等生物学过程中的作用和机制尚不清楚。由于肿瘤的获得性耐药是一个特殊的肿瘤生物学过程，对肿瘤具有抑制作用的药物不一定具有逆转肿瘤获得性耐药的功能。而且，药物之间具有联合之后的协调效应，也不意味着其中的一个药物可以逆转肿瘤对另外一个药物的耐药。更进一步的SphK2在肿瘤发生发展中的作用尚存在争议，且肿瘤耐药与肿瘤的其他生物学行为不同、有其特殊之处，因此其在耐药中的作用和机制尚不清楚。肝癌对瑞戈非尼的获得性耐药也是一个刚刚出现研究命题，其过程和机制尚不清楚，因此，敲减SphK2能否对肝癌的瑞戈非尼获得性耐药产生逆转作用尚存争议。因此，目前敲减SphK2能否在HCC上展示抑癌效果不得而知，更进一步其能否逆转HCC对瑞戈非尼的耐药也处于迷茫之中。本专利技术将通过体外HCC瑞戈非尼获得性耐药模型评估敲减SphK2的小干扰RNA对获得性耐药的逆转作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过体外研究揭示SphK2在肝癌细胞对瑞戈非尼获得性耐药中的作用，并且用小干扰RNA敲减SphK2的方法来逆转了肝癌细胞对瑞戈非尼的耐药。因此，本专利技术的主要内容概括为：采用小干扰RNA敲减SphK2的方法降低SphK2表达量能够逆转肝癌对瑞戈非尼的耐药，敲减SphK2的小干扰RNA能够用于制备逆转肝癌对瑞戈非尼耐药的药物。本
技术实现思路
详细情况如下：1.我们首次揭示瑞戈非尼对耐药HCC细胞抑制增殖和促进凋亡的作用显著下降，耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性降低；2.我们首次揭示SphK2在耐药细胞中的表达比在非耐药细胞中高，而SphK1在两种细胞中的表达没有明显差别，且SphK2的表达量与HCC细胞对瑞戈非尼的敏感度具有负相关关系；3.我们首次揭示SphK2的催化产物S1P刺激非耐药细胞也可以促进细胞对瑞戈非尼产生抵抗。4.我们首次揭示过表达SphK2可以降低非耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性，促进耐药发生；5.我们首次使用敲减SphK2的小干扰RNA降低SphK2蛋白表达水平后，耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性升高，逆转耐药。联合应用敲减SphK2的小干扰RNA瑞戈非尼具有显著体外逆转对瑞戈非尼耐药的逆转效果。由此可见，敲减SphK2的小干扰RNA可以用于肿瘤对瑞戈非尼获得性耐药的逆转。附图说明图1.瑞戈非尼获得性耐药细胞的构建：(A)瑞戈非尼耐药细胞和非耐药母系细胞用不同浓度瑞戈非尼(0、0.5、1、5、10、20、40(μmol/l))处理48h后，CCK-8检测细胞活力，并计算相应的IC50值。(B)10μmol/l瑞戈非尼处理瑞戈非尼获得性耐药细胞97H-R、7721-R和非耐药母系细胞48h后，分别检测两种细胞的凋亡比例。(C)10μmol/l瑞戈非尼处理耐药细胞和母系细胞48h后，分别检测凋亡细胞的比例。(D)在克隆形成实验中，用5μmol/l瑞戈非尼抑制耐药细胞和母系细胞的增殖，7721和7721-R连续培养14天，97H和97H-R连续培养10天，检测瑞戈非尼对细胞增殖的影响。(E)10μmol/l瑞戈非尼处理耐药细胞和母系细胞48h后，westernblot检测不同组细胞中Bcl2、cleaved-PARP、CDK2、CKD4、cyclinD1的蛋白表达水平，根据实验结果分析各条带灰度值。图中所示结果为三次独立实验中具有代表性的实验结果，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图2.SphK2而非SphK1在与HCC瑞戈非尼耐药相关：(A)Westernblot检测瑞戈非尼获得性耐药细胞97H-R、7721-R与对应的非耐药母系细胞MHCC97H、SMMC-7721中SphK1蛋白表达量的差异。(B)瑞戈非尼获得性耐药细胞与非耐药母系细胞SphK2蛋白表达量的差异。(C)Westernblot检测BEL-7402、HuH-7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、MHCC97H五株HCC细胞SphK2的蛋白表达水平，并分析各株细胞SphK2条带灰度值与瑞戈非尼IC50值的关系。图中所示结果为三次独立实验中具有代表性的实验结果，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS：没有显著统计学差异。图3.降低耐药细胞SphK2蛋白表达水平后，细胞对瑞戈非尼敏感性升高：(A)SphK2-siRNA或阴性对照siRNA干扰瑞戈非尼获得性耐药细胞97H-R、7721-R后，Westernblot检测细胞SphK2的蛋白表达量确认是否敲除成功，根据结果用ImageJ分析各条带灰度值。(B)成功降低耐药细胞SphK2蛋白表达水平后，用不同浓度的瑞戈非尼(0、0.5、1、5、10、20、40(μmol/l))处理细胞48h，CCK-8实验检测细胞活力并计算相应的瑞戈非尼IC50值。(C)用10μmol/l瑞戈非尼分别处理SphK2干扰成功的耐药细胞和对照细胞48h后，AnnexinV-FITC/PI检测凋亡细胞的比例。(D)10μmol/l瑞戈非尼分别处理SphK2干扰成功的耐药细胞和对照细胞48h后，流式细胞周期实验检测细胞周期的分布。(E)在克隆形成实验中瑞戈非尼的浓度为5μmol/l，处理时间分别为：7721-R14天，97H-R10天，检测敲除SphK2后瑞戈非尼对耐药细胞增殖能力的影响。(F)10μmol/l瑞戈非尼处理SphK2干扰成功的耐药细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.敲减SphK2的小干扰RNA与瑞戈非尼的组合物在制备治疗肝癌药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.敲减SphK2的小干扰RNA与瑞戈非尼的组合物在制备治疗肝癌药物中的应用。


2.如权利要求1所述的敲减SphK2的小干扰RNA与瑞戈非尼的组合物在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征为小干扰RNA的序列如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。


3.敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肿瘤对瑞戈非尼耐药的药物中的应用。


4.如权利要求3所述的敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肿瘤对瑞戈非尼耐药的药物中的应用，其特征为小干扰RNA的序列如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。


5.如权利要求3所述的敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肿瘤对瑞戈非尼耐药的药物中的应用，其特征为所述肿瘤为肝癌。


6.如权利要求5所述的敲减SphK2的小干扰RNA在制备逆转肿瘤对...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊华，江春平，石维维，王忠夏，刘淑雯，胡丽丽，马丁，张广，曹胤，张姗，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32