一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型及其制备方法和应用。所述3D共培养模型包括成纤维细胞液滴与癌细胞液滴；所述成纤维细胞液滴与癌细胞液滴之间通过Matrigel通道相连。所述3D共培养模型呈“哑铃型”，接种前期能够单独培养成纤维细胞和癌细胞，使两者在相互作用之前有各自独立生长的阶段；同时，通过Matrigel通道能够在培养一段时间后观察到成纤维细胞和癌细胞之间发生相互作用时发生的形态变化，为研究成纤维细胞和癌细胞的独立生长与相互影响的过程提供了观察的窗口期。

【技术实现步骤摘要】
一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型及其制备方法和应用
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于研究成纤维细胞引导的癌细胞定向迁移的3D共培养模型及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤是由恶性肿瘤细胞以及周围大量的基质细胞所构成的复合体。基质细胞主要包括成纤维细胞、浸润的免疫细胞、血管和细胞外基质(ECM)大分子等，能够为肿瘤细胞外环境提供结构和生化成分上的支持。基质细胞以及各种细胞因子和趋化因子共同构成了肿瘤微环境，能够与肿瘤细胞相互影响，共同演化从而促进肿瘤的生长。肿瘤组织中的成纤维细胞被统称为肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)，是肿瘤微环境中最主要的基质细胞。作为近期肿瘤研究的热门领域之一，越来越多的体外和临床研究表明CAFs在肿瘤的生长、转移、耐药以及存活等方面发挥至关重要的作用。与普通成纤维细胞相比，CAFs是一种特殊的处于不可逆激活状态下的成纤维细胞，生长增值速度更快且细胞活动更加活跃，通过分泌多种生长因子以及对细胞外基质的重构，能够促进癌细胞的增殖，分化和侵袭。普通成纤维细胞可以在生长因子和机械压力等外部刺激下被激活而具有类似CAFs的功能。目前为止，对成纤维细胞与肿瘤细胞之间的相互作用机制的研究多侧重于间接的相互作用如旁分泌机制，成纤维细胞通过分泌生长因子等调节癌细胞的增殖和扩散，但对于两种细胞之间直接接触产生的物理相互作用对肿瘤的发展所产生的影响了解甚少。对成纤维细胞与癌细胞之间直接相互作用的研究需要将两种细胞在合适的模型下进行共同培养，而传统的2D单层细胞培养缺乏立体的结构，难以为两种细胞的相互作用提供合适的环境。另一方面，由于组织环境的复杂性和不可穿透性，动物模型也无法对不同细胞间的相互作用进行仔细的观察和研究。虽然有些无创的成像技术可以实现对细胞的体内追踪，但这些技术通常比较复杂昂贵，并且很难获得对细胞间的相互作用的高质量图像。3D细胞培养是一种在体外通过立体培养模式为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境的新型培养方式，在近几年发展迅速，成为肿瘤药物筛选和组织工程领域中有力的工具。越来越多的研究致力于揭示癌细胞在体外3D环境中是如何增殖及转移的，以及成纤维细胞对这些过程所产生的促进作用。有实验结果表明将成纤维细胞和癌细胞在3D环境下共同培养，对两种细胞的侵袭能力都有显著的提升，并且能观察到癌细胞通过粘附在成纤维细胞形成的突起上跟随成纤维细胞进行侵袭。类似有关成纤维细胞对癌细胞转移的引导作用的研究都表明，成纤维细胞在分泌生长刺激因子的同时，也可以通过细胞间的直接相互作用对癌细胞的转移侵袭进行调节。目前，现有的3D共培养模型无法对其中单个细胞的生长过程进行单独的观察，也不能为研究不同细胞的独立生长、产生相互影响的关联与过程提供观察的窗口期，所以将两种细胞间的吸引和相互作用的过程可视化并实时的观察追踪是此类研究中所面临的主要困难之一，但尚没有成熟的模型能够模拟这一过程。因此，提供一种能够实时的观察追踪成纤维细胞与癌细胞之间吸引和相互作用的3D培养模型，对于研究癌细胞的生长、转移、耐药以及存活等方面具有重要的意义。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型及其制备方法和应用。所述3D共培养模型能够有效实现成纤维细胞与癌细胞之间吸引和相互作用的可视化及实时追踪，可应用于成纤维细胞引导的癌细胞迁移的体外研究。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型，所述3D共培养模型包括成纤维细胞液滴与癌细胞液滴；所述成纤维细胞液滴与癌细胞液滴之间通过Matrigel通道相连。本专利技术提供的成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型，是将成纤维细胞和癌细胞分别接种在3D培养基悬液中，形成两种相互独立的细胞液滴，使得成纤维细胞和癌细胞在相互作用之前有各自独立生长的阶段；同时，所述3D共培养模型于细胞液滴之间构建Matrigel通道，得到一种3D“哑铃型”的细胞培养模型，使得成纤维细胞与癌细胞能够通过细胞因子等物质或其他影响因子的交换发生相互作用。在两种细胞之间构建可供3D移动的Matrigel通道，将成纤维细胞的浸润前沿限制在固定的区域内，可以对两种细胞之间相互吸引并迁移的过程的各个阶段实现及时的监测和观察；继而成纤维细胞向癌细胞发生定向迁移，成纤维细胞迁移过Matrigel通道与癌细胞产生接触后，可以观察到癌细胞通过粘附成纤维细胞的脉管上随着成纤维细胞的收缩产生移动；从而便于研究成纤维细胞通过物理接触的直接作用对癌细胞的迁移侵袭所产生的影响；同时，在整个培养过程中，这种直接的相互作用及影响可以在共培养过程中被直观的可视化，便于研究成纤维细胞与癌细胞之间的形态变化；因此，所述3D共培养模型中的两种细胞在3D环境中各自独立的生长特性以及成纤维细胞对癌细胞的吸引和引导其迁移侵袭的过程都可以用此共培养模型进行观察研究。相较于现有的3D细胞共培养体系，本专利技术在最开始接种细胞时就将两种细胞类型单独培养在3D模型中，但是两者之间又并未完全分离，在独自生长一定时间后又能够相互影响。作为本专利技术优选的技术方案，所述Matrigel通道的长度为1～5mm，例如可以是1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm等，优选为1～2mm。本专利技术中，所述Matrigel通道的长度较为关键，若是长度大于2mm会相应增长培养时间，也可以进行观察，但如果两细胞间距离过大，超过5mm，成纤维细胞与癌细胞之间距离过远，容易导致两细胞间吸引作用不足，两种细胞之间无法产生相互作用，导致成纤维细胞无法向癌细胞定向迁移，最终无法接触融合；若是长度小于1mm，会导致成纤维细胞迁移至癌细胞的时间过短，容易导致成纤维细胞自身3D突起的形成不充分，且对两种细胞互相吸引的过程观察窗口期较短。因此，把握Matrigel通道的长度对于研究细胞间相互作用尤为重要，其长度优选为1～2mm。优选地，所述Matrigel通道由Matrigel溶液凝固后形成，所述Matrigel溶液中Matrigel的质量分数为30～80％，例如可以是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％等。通道组分尽量保持与细胞液滴中的成分相同，保证细胞生长过程中的一致性，优选为30～50％。作为本专利技术优选的技术方案，所述成纤维细胞液滴中成纤维细胞的浓度为(2～10)×105个/mL，例如可以是2×105个/mL、3×105个/mL、5×105个/mL、8×105个/mL、9×105个/mL或10×105个/mL等。优选地，所述癌细胞液滴中癌细胞的浓度为(2～10)×105个/mL，例如可以是2×105个/mL、3×105个/mL、5×105个/mL、8×105个/mL、9×105个/mL或10×105个/mL等。优选地，所述成纤维细胞液滴中Ma本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型，其特征在于，所述3D共培养模型包括成纤维细胞液滴与癌细胞液滴；/n所述成纤维细胞液滴与癌细胞液滴之间通过Matrigel通道相连。/n

【技术特征摘要】
1.一种成纤维细胞与癌细胞的3D共培养模型，其特征在于，所述3D共培养模型包括成纤维细胞液滴与癌细胞液滴；
所述成纤维细胞液滴与癌细胞液滴之间通过Matrigel通道相连。


2.根据权利要求1所述的3D共培养模型，其特征在于，所述Matrigel通道的长度为1～5mm，优选为1～2mm；
优选地，所述Matrigel通道由Matrigel溶液凝固后形成，所述Matrigel溶液中Matrigel的质量分数为30～80％，优选为30～50％。


3.根据权利要求1或2所述的3D共培养模型，其特征在于，所述成纤维细胞液滴中成纤维细胞的浓度为(2～10)×105个/mL；
优选地，所述癌细胞液滴中癌细胞的浓度为(2～10)×105个/mL；
优选地，所述成纤维细胞液滴中Matrigel的质量分数为30～80％；
优选地，所述癌细胞液滴中Matrigel的质量分数为30～80％。


4.根据权利要求1～3任一项所述的3D共培养模型，其特征在于，所述3D共培养模型还包括包覆培养基，所述包覆培养基用于包被所述成纤维细胞液滴、癌细胞液滴和Matrigel通道；
优选地，所述包覆培养基包括DMEM培养基。


5.根据权利要求1～4任一项所述的3D共培养模型，其特征在于，所述癌细胞包括结肠癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、食管癌细胞、宫颈癌细胞、人类黑素瘤细胞或肺腺癌细胞中的任意一种；
优选地，包括CaKi-1、HeLa、A375或A549中的任意一种；
优选地，所述成纤维细胞包括BHK-21细胞。


6.一种如1～5任一项所述的3D共培养模型的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将成纤维细胞和癌细胞分别重悬于培养基中，加入Matrigel制备得到成纤维细胞悬液和癌细胞悬液；
(2)再将所述成纤维细胞悬液和癌细胞悬液分别加在培养器皿上，而后凝固，所得到的成纤维细胞液滴与癌细胞液滴之间留有间隔；
(3)在所述的间隔中加入Matrigel溶液，凝固后形成Matrigel通道，再加入包覆培养基后得到所述3D...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明辉，张一荷，姜冰洁，
申请(专利权)人：西交利物浦大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32